一种重组蛋白及荧光检测底物的方法技术

本发明专利技术提供了一种重组蛋白及荧光检测底物的方法，具体为一种融合蛋白eYFPa

【技术实现步骤摘要】
一种重组蛋白及荧光检测底物的方法


[0001]本专利技术属于生物工程
，具体为一种重组蛋白及荧光检测底物的方法。

技术介绍

[0002]聚半乳糖醛酸(Poly galacturonic acid)是果胶的主要组成部分,果胶(pectin)是由半乳糖醛酸通过α
‑
1，4糖苷键连接而成的多聚物，在植物的整个生长发育过程中具有十分重要的作用。由于果胶降解不完全能够形成不同聚合度的聚半乳糖醛酸，作为一种功能性聚糖对动植物具有生物活性，例如抑菌、促进生长发育、抗癌等。
[0003]碳水化合物结合结构域(Carbohydrate
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binding modules，简称CBM)是与碳水化合物结合的非催化蛋白结构域，不具有催化活性但参与碳水化合物降解的多糖结合模块，已在微生物中得到充分研究。它能够特异性结合多糖，有效提高碳水化合物酶的催化效率，因其独特的结合特性也成为了研究蛋白质
‑
碳水化合物作用机制的模型。荧光探针可针对特定的目标物质产生荧光信号，进而达到分析检测的目的。作为一种重要检测手段，荧光探针的应用范围非常广泛，涉及生物医学、生命科学以及环境等方面。接下来各领域的交流将会使其应用的领域更加广泛。
[0004]随着蛋白质组学、合成生物学和计算机模拟技术的快速发展，研究人员可以借助使用CBM融合来达到探针筛选的作用。此外，目前多数研究针对多样CBM融合碳水化合物酶，以此提高酶分子的催化活性、稳定性以及酶分子与底物的结合特异性，但是利用CBM与荧光蛋白融合作为探针检测底物的方法仍然较少。
[0005]中国专利文献CN113881616(申请号：202111185375.6)公开了一种细菌纤维素基生物传感器及其应用。该专利文献公开了一种细菌纤维素基生物传感器，包括细菌纤维素和表面展示纤维素结合结构域CBM的细胞，其中，纤维素结合结构域CBM为可特异性结合纤维素结晶区的纤维素结合结构域，细胞通过纤维素结合结构域CBM与细菌纤维素链接。并未涉及对果胶、聚半乳糖醛酸的检测。

技术实现思路

[0006]针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种重组蛋白及荧光检测底物的方法。
[0007]专利技术人将基因YeCBM32的N端通过Linker(连接肽)添加eYFP基因的a段(氨基酸序列1
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155)构建融合蛋白eYFPa
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YeCBM32，YeCBM32的C端通过Linker(连接肽)添加eYFP基因的b段(氨基酸序列156
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238)构建融合蛋白YeCBM32
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eYFPb。本专利技术发现这两个融合蛋白eYFPa
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YeCBM32、YeCBM32
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eYFPb由于分别带有黄色荧光蛋白基因的a、b段，故而在与特异性底物果胶或聚半乳糖醛酸同时发生结合时，能够产生强烈荧光，而融合蛋白eYFPa
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YeCBM32、融合蛋白YeCBM32
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eYFPb不与底物结合时不产生明显荧光，根据荧光强度可以检测果胶或聚半乳糖醛酸。
[0008]本专利技术技术方案如下：
[0009]一种融合蛋白eYFPa
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YeCBM32编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0010]一种融合蛋白eYFPa
‑
YeCBM32的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0011]一种融合蛋白YeCBM32
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eYFPb编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0012]一种融合蛋白YeCBM32
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eYFPb的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
[0013]一种重组载体，包含上述融合蛋白eYFPa
‑
YeCBM32编码基因的核苷酸序列，如SEQ ID NO.1所示。
[0014]一种重组载体，包含上述融合蛋白YeCBM32
‑
eYFPb编码基因的核苷酸序列，如SEQ ID NO.3所示。
[0015]一种重组菌，包含上述融合蛋白eYFPa
‑
YeCBM32编码基因的核苷酸序列，如SEQ ID NO.1所示。
[0016]一种重组菌，包含上述融合蛋白YeCBM32
‑
eYFPb编码基因的核苷酸序列，如SEQ ID NO.3所示。
[0017]一种含融合蛋白eYFPa
‑
YeCBM32基因的大肠杆菌工程菌的构建方法，包括如下步骤：
[0018](1)合成融合蛋白eYFPa
‑
YeCBM32基因片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
[0019](2)将步骤(1)中制得的融合蛋白eYFPa
‑
YeCBM32基因片段插入pET
‑
20b(+)载体，得到重组质粒pET
‑
20b(+)
‑
eYFPa
‑
YeCBM32；
[0020](3)制备大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，将步骤(2)制得的重组质粒pET
‑
20b(+)
‑
eYFPa
‑
YeCBM32转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，筛选阳性克隆，即得含融合蛋白eYFPa
‑
YeCBM32基因的大肠杆菌工程菌。
[0021]一种含融合蛋白YeCBM32
‑
eYFPb基因的大肠杆菌工程菌的构建方法，包括如下步骤：
[0022]①
合成融合蛋白YeCBM32
‑
eYFPb基因片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
[0023]②
将步骤
①
中制得的融合蛋白YeCBM32
‑
eYFPb基因片段插入pET
‑
20b(+)载体，得到重组质粒pET
‑
20b(+)
‑
YeCBM32
‑
eYFPb；
[0024]③
制备大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，将步骤
②
制得的重组质粒pET
‑
20b(+)
‑
YeCBM32
‑
eYFPb转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，筛选阳性克隆，即得含融合蛋白YeCBM32
‑
eYFPb基因的大肠杆菌工程菌。
[0025]根据本专利技术优选的，上述步骤(3)或步骤
③
中筛选阳性克隆的方法为，将转化细胞涂布在含有100μg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基上，37℃培养，挑取单菌落接种至含有100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中37℃过夜培养，然后通过PCR验证，得到目的基因条带的阳性克隆子，测序后，保本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种融合蛋白eYFPa
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YeCBM32编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.一种融合蛋白eYFPa
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YeCBM32的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。3.一种融合蛋白YeCBM32
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eYFPb编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。4.一种融合蛋白YeCBM32
‑
eYFPb的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。5.一种重组载体，其特征在于，包含权利要求1所述融合蛋白eYFPa
‑
YeCBM32编码基因的核苷酸序列，如SEQ ID NO.1所示；优选的，一种重组菌，包含权利要求1所述融合蛋白eYFPa
‑
YeCBM32编码基因的核苷酸序列，如SEQ ID NO.1所示。6.一种重组载体，其特征在于，包含权利要求3所述融合蛋白YeCBM32
‑
eYFPb编码基因的核苷酸序列，如SEQ ID NO.3所示；优选的，一种重组菌，包含权利要求3所述融合蛋白YeCBM32
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eYFPb编码基因的核苷酸序列，如SEQ ID NO.3所示。7.一种含融合蛋白eYFPa
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YeCBM32基因的大肠杆菌工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)合成融合蛋白eYFPa
‑
YeCBM32基因片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；(2)将步骤(1)中制得的融合蛋白eYFPa
‑
YeCBM32基因片段插入pET
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20b(+)载体，得到重组质粒pET
‑
20b(+)
‑
eYFPa
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YeCBM32；(3)制备大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，将步骤(2)制得的重组质粒pET
‑
20b(+)
‑
eYFPa
‑
YeCBM32转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，筛选阳性克隆，即得含融合蛋白eYFPa
‑
YeCBM32基因的大肠杆菌工程菌；优选的，一种含融合蛋白YeCBM32
‑
eYFPb基因的大肠杆菌工程菌的构建方法，包括如下步骤：
①
合成融合蛋白YeCBM32
‑
eYFPb基因片段，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：李丕武，魏晓凤，汪俊卿，王瑞明，苏静，王婷，张子洋，杨翠平，马俊，
申请(专利权)人：齐鲁工业大学，
类型：发明
国别省市：