一种有核细胞表面连接蛋白的方法及其应用技术

本发明专利技术属于细胞工程领域，公开了一种有核细胞表面连接蛋白的方法及其应用。这种方法包括：对有核细胞进行巯基化修饰，得到活化的有核细胞；对蛋白进行马来酰亚胺化修饰，得到活化蛋白；将活化的有核细胞和活化蛋白混合孵育，使活化蛋白与活化的有核细胞偶联。该方法能高效地将蛋白连接在有核细胞表面，但不影响细胞活力，可用于提高有核细胞靶向迁徙能力，及特异性结合损伤组织的能力。及特异性结合损伤组织的能力。及特异性结合损伤组织的能力。

【技术实现步骤摘要】
一种有核细胞表面连接蛋白的方法及其应用


[0001]本专利技术属于细胞工程领域，具体涉及一种有核细胞表面连接蛋白的方法及其应用。

技术介绍

[0002]对于一些具有组织修复能力或抑制、清除能力的细胞，通常需要特异性结合或靶向迁徙到待修复或待抑制、清除的细胞周围，以发挥相应的作用。如间充质干细胞(MSCs)是中胚层来源的干细胞，具有易获得、易培养、低免疫原性等优点，MSCs能在宿主体内长期存活并在微环境诱导下迁徙到损伤部位分化形成组织细胞，参与组织修复，但是MSCs在体外扩增培养后存在靶向迁徙能力不足的缺陷。这主要是由于MSCs在体外培养的过程中，其表面丢失了靶向迁徙所需的表面分子，如选择素配体、整合素、趋化因子等。通过增加这些表面分子的表达水平，可以恢复MSCs的迁徙能力，传统的方法是增加MSCs对编码这些表面分子的基因的表达，但是这种方法较复杂，需要对细胞进行基因改造才能上调这些表面分子的表达，且这种方法产生的表面分子是通过非共价键(如氢键、疏水键或范德华力等)结合到细胞上的，这种结合的结合强度较低，细胞与靶组织结合不牢固。
[0003]因此，有必要提供一种在细胞表面高效连接蛋白的方法。

技术实现思路

[0004]本专利技术旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本专利技术提出一种有核细胞表面连接蛋白的方法，能够高效地将蛋白连接在有核细胞表面，但不影响细胞活力。
[0005]本专利技术还提出一种有核细胞。
[0006]本专利技术还提出有核细胞表面连接蛋白的方法或有核细胞在制备靶向组织损伤部位和/或肿瘤细胞的产品中的应用。
[0007]本专利技术还提出一种组合物。
[0008]根据本专利技术的一个方面，提出了一种有核细胞表面连接蛋白的方法，包括以下步骤：
[0009]S1：对有核细胞进行巯基化修饰，得到活化的有核细胞；对所述蛋白进行马来酰亚胺化修饰，得到活化蛋白；
[0010]S2：将所述活化的有核细胞和所述活化蛋白混合孵育，使所述活化蛋白与所述活化的有核细胞偶联。
[0011]根据本专利技术的一种优选的实施方式，至少具有以下有益效果：
[0012]本专利技术首先对待连接的蛋白进行马来酰亚胺化修饰，对有核细胞进行巯基化修饰，马来酰亚胺基团和巯基基团可以共价结合，这种通过化学修饰形成的共价结合的强度要高于细胞表面配体
‑
受体之间的非共价结合(如氢键、疏水键、范德华力等)的强度；且在进行巯基化修饰时，可以使得有核细胞表面可同时连接大量的待连接的蛋白。
[0013]因此，本专利技术将有核细胞同时与大量的待连接蛋白通过共价结合而连接，实现了有核细胞表面高效率地连接蛋白，进而促进有核细胞高效发挥其相应的功能。
[0014]在本专利技术的一些实施方式中，所述有核细胞包括但不限于间充质干细胞、免疫细胞。
[0015]在本专利技术的一些实施方式中，用于所述马来酰亚胺化修饰的试剂包含NHS酯基团和与所述NHS酯基团相连的马来酰亚胺基团。
[0016]在本专利技术的一些实施方式中，所述NHS酯基团通过环己烷间隔臂连接所述马来酰亚胺基团。
[0017]在本专利技术的一些实施方式中，所述NHS酯基团为磺基
‑
NHS酯基团。
[0018]在本专利技术的一些实施方式中，所述试剂通过NHS酯基团与待连接的蛋白的氨基(
‑
NH2)反应，从而对蛋白进行马来酰亚胺化修饰，得到活化蛋白。
[0019]在本专利技术的一些优选的实施方式中，用于对所述蛋白进行马来酰亚胺化修饰的试剂为4
‑
(N
‑
马来酰亚胺甲基)环己烷
‑1‑
羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐(Sulfo
‑
SMCC)。
[0020]在本专利技术的一些实施方式中，巯基化试剂与所述有核细胞的氨基反应，将巯基引入所述有核细胞中，实现对所述有核细胞的巯基化修饰，得到活化的有核细胞。可以理解的是，在其中一些具体的实施方式中，巯基化试剂与有核细胞表面的蛋白反应完成活化，有核细胞表面的蛋白例如可以是膜蛋白，例如外周膜蛋白、整合蛋白或脂锚定蛋白等其中的至少一种。
[0021]在本专利技术的一些优选的实施方式中，用于巯基化修饰的试剂为2
‑
氨基硫代乙烷盐酸盐(Trauts)试剂。
[0022]在本专利技术的一些优选的实施方式中，所述有核细胞与所述Trants试剂的比例为100万个有核细胞：0.1～50μg Trants试剂，进一步，比例为100万个有核细胞：0.1～20μg Trants试剂、0.1～10μg Trants试剂、0.1～5μg Trants试剂、0.1～2μg Trants试剂、0.1～1μg Trants试剂。
[0023]在本专利技术的一些实施方式中，用于巯基化修饰的试剂的浓度为0.1～100μg/mL，进一步为0.1～50μg/mL、0.1～20μg/mL、0.1～10μg/mL、0.1～5μg/mL、0.1～2μg/mL。
[0024]在本专利技术的一些实施方式中，用于马来酰亚胺化修饰的试剂与蛋白混合的摩尔比为(10～100)：1。
[0025]在本专利技术的一些实施方式中，将所述待活化蛋白偶联到所述有核细胞表面后，所述有核细胞的存活率为80％～99％，例如80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％。具体的，有核细胞的存活率在85％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上。
[0026]本专利技术中巯基化试剂与有核细胞混合时，用于巯基化修饰的试剂的浓度只需要在0.1～100μg/mL范围内，即只需加入较低剂量的巯基化试剂即可完成对膜蛋白的巯基化修饰，该浓度范围不仅可以实现对膜蛋白的高效修饰，而且对有核细胞的活力的影响较小。
[0027]在本专利技术的一些实施方式中，步骤S1中将用于马来酰亚胺化修饰的试剂与所述蛋白混合加入缓冲液中，于23℃～26℃条件下反应1.9～2h，完成对蛋白的马来酰亚胺化修饰。
[0028]在本专利技术的一些优选的实施方式中，步骤S1中将用于马来酰亚胺化修饰的试剂与
所述蛋白混合加入缓冲液中，于25℃条件下反应2h。
[0029]在本专利技术的一些实施方式中，用于马来酰亚胺化修饰的试剂与所述蛋白反应1.9～2h后，再于4℃～6℃条件下透析过夜，期间需更换透析液2～3次。
[0030]在本专利技术的一些优选的实施方式中，用于马来酰亚胺化修饰的试剂与所述蛋白反应2h后，再于4℃条件下透析过夜，期间需更换透析液2次。
[0031]在本专利技术的一些实施方式中，步骤S1中，将用于巯基化修饰的试剂与所述有核细胞混合后加入缓冲液中，于4℃～6℃条件下反应，每8～10min摇晃3～5次，共反应30～35min，完成对有核细胞的巯基化修饰。
[0032]在本专利技术的一些优选的实施方式中，步骤S1中，将本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种有核细胞表面连接蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1：对所述有核细胞进行巯基化修饰，得到活化的有核细胞；对所述蛋白进行马来酰亚胺化修饰，得到活化蛋白；S2：将所述活化的有核细胞和所述活化蛋白混合孵育，使所述活化蛋白与所述活化的有核细胞偶联。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述S1中采用Trants试剂进行巯基化修饰，所述有核细胞与所述Trants试剂的比例为100万个有核细胞：0.1～50μg Trants试剂。3.有核细胞，其特征在于，所述有核细胞通过巯基
‑
马来酰亚胺基团的方式连接有蛋白。4.根据权利要求3所述的有核细胞，其特征在于，所述有核细胞包括间充质干细胞。...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴耀炯，董艳凯，
申请(专利权)人：清华大学深圳国际研究生院，
类型：发明
国别省市：