一种获得完整细胞三维培养物的方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种获得完整细胞三维培养物的方法及应用，方法包括将细胞和培养基质置于小室内，所述小室设有便于培养基穿透的孔，其底部可移除；将小室悬浮培养在可以容纳所述小室的培养器中，在培养器中加入培养基，培养至获得所需成熟度的细胞三维培养物；将所述小室取出，在固定液中固定，移除所述小室的底部，推出得到完整的细胞三维培养物。培养结束后，将上层小室整个浸入固定液中，待固定完成，移除底部，此时上层小室就变成一个两端开口的筒，可以轻松将培养完成的培养物推出，得到完整的细胞三维培养物。后续可以采用组织切片等方法获得细胞培养物的切片，再对切片进行常规的免疫组化、免疫荧光等染色操作步骤，操作大大简化。大简化。

【技术实现步骤摘要】
一种获得完整细胞三维培养物的方法及应用


[0001]本专利技术属于生物领域，具体涉及一种获得完整细胞三维培养物的方法及应用。

技术介绍

[0002]细胞三维培养技术是指将细胞在材料载体所提供的三维空间中培养，材料载体支持细胞存活和特定功能发挥，最终可构建成一种三维细胞
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材料载体复合物。与二维细胞培养相比，三维环境中的细胞往往更容易受到形态和生理变化的影响，更能反应细胞在体内的真实生长情况和细胞间的相互作用。因此，三维细胞培养在细胞扩增、组织工程、药物筛选、再生医学等生物医学工程领域具有巨大应用潜力。
[0003]现有的细胞三维培养，一般是将细胞与基质胶混合，之后培养在培养皿中。为了方便观察，该种培养皿底部设计为玻片，培养基质和细胞球种植在底层的玻片上，培养结束后直接在培养皿里进行固定、染色等操作。在应用过程中，存在如下问题：1. 样本固定效果不好，染色过程中容易脱落、变形；2.染色步骤繁琐，需要特殊的试剂；3.直接对细胞三维培养物进行染色时，内层的细胞染色效果不好；4.染色后观察不方便，要观察Z轴的细胞需要用共聚焦层层扫描，十分耗时，且分辨率不高；5.同一个细胞三维培养物可检测的指标有限，一般只有2
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3种。
[0004]为了更好地观察、研究，需要从培养器中取下完整的细胞三维培养组织，但是细胞三维培养得到的组织团，本身的强度较低，在较大力的作用下，会破碎，失去原有的仿生结构。这导致人们基本难以对细胞三维培养得到的细胞团进行充分的研究和观察。

技术实现思路
<br/>[0005]本专利技术的目的在于克服现有技术的至少一个不足，提供一种获得完整细胞三维培养物的方法。
[0006]本专利技术所采取的技术方案是：本专利技术的第一个方面，提供：一种获得完整细胞三维培养物的方法，包括如下步骤：S1) 将细胞和培养基质置于小室内，所述小室设有便于培养基穿透的孔，其底部可移除；S2) 将小室悬浮培养在可以容纳所述小室的培养器中，在培养器中加入培养基，培养至获得所需成熟度的细胞三维培养物；S3) 将所述小室取出，在固定液中固定，移除所述小室的底部，推出得到完整的细胞三维培养物。
[0007]在一些方法的实例中，所述孔设置在所述小室的侧壁和/或底部。
[0008]在一些方法的实例中，所述底部卡接在所述小室的侧壁。
[0009]在一些方法的实例中，所述底部粘接在所述小室的侧壁。
[0010]在一些方法的实例中，所述底部为柔性膜。
[0011]在一些方法的实例中，所述柔性膜设有微孔。
[0012]在一些方法的实例中，在所述底部的上表面形成基质胶层，将细胞接种于基质胶上方，形成多层细胞的三维培养物；或者将细胞与基质胶的混合物置于所述底部的上表面进行培养，细胞在基质胶里形成类球状三维培养物。
[0013]在一些方法的实例中，所述细胞选自肿瘤细胞、干细胞、肌细胞、上皮细胞、神经细胞、骨细胞中的至少一种。
[0014]本专利技术的第二个方面，提供：一种细胞三维培养物的染色方法，包括如下步骤：按本专利技术第一个方面所述的方法获得完整的细胞三维培养物；将取出的完整细胞三维培养物切片、染色。
[0015]本专利技术的有益效果是：本专利技术一些实例的方法，培养基质和细胞置于上层小室，培养基置于下层皿，因上层小室有空隙，下层的培养基能渗透至上层，使得上层的细胞能吸收培养基中的营养物质。培养结束后，将上层小室整个浸入固定液中，待固定完成，移除底部，此时上层小室就变成一个两端开口的筒，可以轻松将培养完成的培养物推出，得到完整的细胞三维培养物。后续可以采用组织切片等方法获得细胞培养物的切片，再对切片进行常规的免疫组化、免疫荧光等染色操作步骤，操作大大简化。
附图说明
[0016]图1是本专利技术一种细胞三维培养方法的示意图。
[0017]图2是本专利技术另一种细胞三维培养方法的示意图。
[0018]图3是本专利技术方法得到的鼻咽癌细胞三维组织的HE染色照片。
[0019]图4是本专利技术方法得到的鼻咽癌细胞三维组织的IHC染色照片。
具体实施方式
[0020]本专利技术的第一个方面，提供：一种获得完整细胞三维培养物的方法，包括如下步骤：S1) 将细胞和培养基质置于小室内，所述小室设有便于培养基穿透的孔，其底部可移除；S2) 将小室悬浮培养在可以容纳所述小室的培养器中，在培养器中加入培养基，培养至获得所需成熟度的细胞三维培养物；S3) 将所述小室取出，在固定液中固定，移除所述小室的底部，推出得到完整的细胞三维培养物。
[0021]通过这种培养方式，可以保证细胞可以充分与培养基接触，利于细胞的生长。培养结束后，移除小室的底部，就可以轻易地将细胞三维培养物推出，得到完整的细胞三维培养物，克服了现有技术难以获得完整细胞三维培养物的不足。
[0022]在一些方法的实例中，所述孔设置在所述小室的侧壁和/或底部。这些孔可以更好地完成物质交换，满足细胞培养的需要。特别的，当底部也设有小孔时，可以更好地保证底部细胞也可以得到充分的营养供给，与传统的细胞三维培养技术相比，底部细胞可以更好
地生长。
[0023]孔的大小可以根据需要进行相应的调整，只要保证培养基可以交换且细胞能在小室内形成三维培养物即可。
[0024]在一些方法的实例中，所述底部卡接在所述小室的侧壁。这样在培养完成后，可以更方便地移除底部。
[0025]在一些方法的实例中，所述底部粘接在所述小室的侧壁。这样易于去除底部。
[0026]在一些方法的实例中，所述底部为柔性膜。
[0027]在一些方法的实例中，所述柔性膜设有微孔。
[0028]在一些方法的实例中，在所述底部的上表面形成基质胶层，将细胞接种于基质胶上方，形成多层细胞的三维培养物(图1)；或者将细胞与基质胶的混合物置于所述底部的上表面进行培养(图2)，细胞在基质胶里形成类球状三维培养物。
[0029]本专利技术方法可以应用于各类细胞的三维培养。在一些方法的实例中，所述细胞选自肿瘤细胞、干细胞、肌细胞、上皮细胞、神经细胞、骨细胞中的至少一种。
[0030]本专利技术的第二个方面，提供：一种细胞三维培养物的染色方法，包括如下步骤：按本专利技术第一个方面所述的方法获得完整的细胞三维培养物；将取出的完整细胞三维培养物切片、染色。
[0031]实验材料：Matrixgel购自BD公司；transwell小室购自康宁公司；E
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cadherin抗体购自CST公司；细胞株和培养基：HONE1（人鼻咽癌细胞株）培养基：DMEM添加10%胎牛血清（FBS）。
[0032]37℃，5%CO2培养，2
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3天传代一次。
[0033]具体实施步骤：1.接种细胞在24孔的transwell上层小室底部加入100ulMatrixgel，置于37℃培养箱中30分钟，待Matrixgel凝固后，在Matrixgel上接种1
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种获得完整细胞三维培养物的方法，包括如下步骤：S1)将细胞和培养基质置于小室内，所述小室设有便于培养基穿透的孔，其底部可移除；S2)将小室悬浮培养在可以容纳所述小室的培养器中，在培养器中加入培养基，培养至获得所需成熟度的细胞三维培养物；S3)将所述小室取出，在固定液中固定，移除所述小室的底部，推出得到完整的细胞三维培养物。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述孔设置在所述小室的侧壁和/或底部。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述底部卡接在所述小室的侧壁。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述底部粘接在所述小室的侧壁。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘强，严敏，雷杰，陈杰伟，
申请(专利权)人：中山大学肿瘤防治中心中山大学附属肿瘤医院，中山大学肿瘤研究所，
类型：发明
国别省市：