用于基因组整合的方法和组合物技术

公开了用于调节靶基因组并将目标转基因稳定整合到细胞的基因组中的方法和组合物。稳定整合到细胞的基因组中的方法和组合物。稳定整合到细胞的基因组中的方法和组合物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于基因组整合的方法和组合物
交叉引用
[0001]本申请要求2019年9月3日提交的美国临时申请号62/895,441、2019年10月1日提交的美国临时申请号62/908,800以及2020年6月15日提交的美国临时申请号63/039,261的权益，每件所述临时申请的全部内容都通过引用并入本文中。

技术介绍

[0002]细胞疗法是一个快速发展的领域，用于解决难以治疗的疾病，诸如癌症、持续性感染和其他治疗形式难以治疗的某些疾病。细胞疗法通常利用离体工程化的细胞并施用于生物体以纠正体内的缺陷。有效且可靠的细胞基因组操纵系统至关重要，因为当工程化细胞被施用到生物体中时，它发挥最佳功能和持久功效。同样，可靠的基因操作机制形成基因疗法成功的基石。然而，以治疗上安全且有效的方式递送核酸货物(cargo)(例如，大货物)的方法存在严重缺陷。病毒递送机制经常用于在细胞中递送大核酸货物，但与安全问题有关，并且不能用于在一些细胞类型中表达货物。此外，对细胞进行重复的基因操作可能影响细胞健康，诱导细胞周期的改变，并使细胞不适合治疗性用途。在该领域中不断寻求进步以有效递送和稳定化用于治疗目的的外源引入的遗传物质。

技术实现思路

[0003]本文提供了用于将遗传物质稳定地非病毒转移和整合到细胞中的组合物和方法。在一方面，遗传物质是自整合型多核苷酸。遗传物质可以稳定地整合到细胞的基因组中。细胞可以是人细胞。所述方法被设计用于将遗传物质安全可靠地整合到细胞的基因组中。
[0004]在一方面，本文提供了允许将遗传物质整合到细胞的基因组中的组合物和方法，其中可以被整合的遗传物质不受大小的具体限制。在一些方面，本文所述的方法提供了在细胞基因组中对遗传“货物”的一步单一多核苷酸介导的递送和整合。遗传物质可以包含编码序列，例如编码转基因、肽、重组蛋白或抗体或其片段的序列，其中所述方法和组合物确保由所述编码序列编码的转录产物的稳定表达。遗传物质可以包含非编码序列，例如调节性RNA序列，例如调节性小抑制性RNA(siRNA)、微RNA(miRNA)、长链非编码RNA(lncRNA)或一种或多种转录调节物，诸如启动子和/或增强子，并且还可以包含但不限于结构生物分子，诸如核糖体RNA(rRNA)、转移RNA(tRNA)或其片段或其组合。
[0005]在另一方面，本文提供了用于通过确保转移的安全性和有效性的非病毒递送将可能不受大小具体限制的遗传物质位点特异性地整合到细胞的基因组中的方法和组合物。所提供的方法和组合物可特别适用于开发治疗剂，诸如包含多核苷酸的治疗剂，所述多核苷酸包含遗传物质和机制，其允许转移到细胞中并稳定整合到多核苷酸或编码多核苷酸的mRNA所转移到的细胞基因组中。在一些实施方案中，治疗剂可以是包含多核苷酸的细胞，所述多核苷酸已通过使用本文所述的方法和组合物而被稳定整合到细胞的基因组中。
[0006]在一方面，本公开提供了用于将基因稳定转移到细胞中的组合物和方法。在一些实施方案中，所述组合物和方法用于将基因稳定转移到免疫细胞中。在一些情况下，免疫细
胞是骨髓细胞。在一些情况下，本文所述的方法涉及开发用于免疫疗法的骨髓细胞。
[0007]使用吞噬细胞的免疫疗法涉及制造和使用工程化的骨髓细胞，诸如巨噬细胞或其他吞噬细胞，它们攻击并杀死患病细胞，诸如癌细胞或受感染的细胞。工程化的骨髓细胞诸如巨噬细胞和其他吞噬细胞是通过重组核酸技术在其中掺入合成的重组核酸来制备的，所述合成的重组核酸编码工程化的蛋白质，诸如嵌合抗原受体，其包含被设计成与靶标(诸如靶细胞，诸如癌细胞)表面上的特异性抗原结合的靶向抗原结合胞外结构域。工程化嵌合受体与靶标上的抗原诸如癌抗原(或类似的疾病靶标)的结合启动对靶标的吞噬。这触发了两方面的作用：一是作为免疫防御的第一道防线，对靶标的吞噬和裂解会破坏靶标并将其消除；二是来自靶标的抗原在骨髓细胞的吞噬溶酶体中被消化，呈递在骨髓细胞表面上，进而导致激活T细胞，并进一步激活免疫应答并形成免疫记忆。嵌合受体被工程化用于对其被掺入和表达所在的骨髓细胞的增强吞噬和免疫激活。本公开的嵌合抗原受体在本文中被不同地称为嵌合融合蛋白、CFP、吞噬细胞受体(PR)融合蛋白(PFP)或用于吞噬的嵌合抗原受体(CAR
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P)，而每个术语都针对重组嵌合和/或融合受体蛋白的概念。在一些实施方案中，编码非受体蛋白的基因也在骨髓细胞中共表达，通常用于增强嵌合抗原受体功能。总之，本文设想了各种工程化的受体和非受体重组蛋白，其被设计成增强骨髓细胞对疾病靶标的吞噬和/或免疫应答；以及用于产生和掺入编码工程化的受体或非受体重组蛋白的重组核酸的方法和组合物，由此所述方法和组合物适用于产生用于免疫疗法的工程化骨髓细胞。
[0008]在一方面，本公开提供了用于将基因稳定转移到细胞中的组合物和方法，其中所述细胞可以是任何体细胞。在一些实施方案中，所述组合物和方法被设计用于细胞特异性或组织特异性递送。在一些情况下，本文所述的方法涉及提供功能性蛋白质或其片段以补偿体内缺失或缺陷(突变)的蛋白质，例如用于蛋白质替代疗法。
[0009]在细胞中重组核酸的掺入可以通过现有技术中可用的一种或多种基因转移技术来实现。然而，出于治疗目的将外源遗传(例如核酸)元件掺入到基因组中仍然面临着一些挑战。以安全可靠的方式实现稳定的整合，以及有效和持久的表达是其中的一小部分。旨在货物核酸序列的基因组整合的大多数成功基因转移系统依赖于病毒递送机制，这具有一些固有的安全性和有效性问题。目前的基因编辑系统无法实现对长核酸序列的递送和整合。
[0010]迄今为止，尚少有关注致力于制造和使用工程化的骨髓细胞来实现稳定的长期基因转移和转基因的表达。例如，可以通过病毒基因转移机制而离体将基因转移到分化的哺乳动物细胞中以用于细胞疗法。然而，存在着与使用病毒基因转移载体(vector)相关的几个策略性劣势，包括随着时间推移转基因沉默的不良潜在性、优先整合到基因组的转录活性位点以及其他基因(例如癌基因)的相关不良激活和遗传毒性。除了安全性问题增加的成本以及制造、储存和处理整合病毒带来的繁琐工作之外，经常阻碍基因修饰的细胞介导的病毒载体在治疗应用中的大规模使用。与病毒载体有关的关于安全性以及载体的生产成本和规模的这些持续不断的问题使得有效疗法的替代方法成为必要。
[0011]将转基因整合到有待用于免疫疗法的细胞基因组中的有利意义可能在于它是稳定的，并且在疗法期间需要递送较少数量的细胞。另一方面，将转基因整合到非分裂细胞中存在的挑战性可能在于影响细胞的健康和功能以及细胞在体内的最终寿命，且因此影响其作为治疗剂的整体效用。在一些实施方案中，本文所述的用于产生供免疫疗法用的骨髓细胞的方法可以是多个步骤和组合物的累积产物，包括但不限于例如选择用于修饰的骨髓细
胞；用于将重组核酸掺入骨髓细胞中的方法和组合物；用于增强重组核酸的表达的方法和组合物；用于选择和修饰载体的方法和组合物；制备适用于体内施用的重组核酸的方法以供骨髓细胞在体内摄取和掺入所述重组核酸并由此产生用于疗法的骨髓本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种将核酸序列整合到细胞的基因组中的方法，所述方法包括将重组mRNA或编码mRNA的载体引入所述细胞中，其中所述mRNA包含：(a)插入序列，其中所述插入序列包含：(i)外源性序列，或(ii)作为所述外源性序列的反向补体的序列；(b)5'UTR序列和所述5'UTR序列下游的3'UTR序列；其中所述5'UTR序列或所述3'UTR序列包含人ORF蛋白的结合位点，并且其中所述插入序列被整合到所述细胞的所述基因组中。2.如权利要求1所述的方法，其中所述5'UTR序列或所述3'UTR序列包含人ORF2p的结合位点。3.一种将核酸序列整合到免疫细胞的基因组中的方法，所述方法包括引入重组mRNA或编码mRNA的载体，其中所述mRNA包含：(a)插入序列，其中所述插入序列包含(i)外源性序列或(ii)作为所述外源性序列的反向补体的序列；(b)5'UTR序列和所述5'UTR序列下游的3'UTR序列；其中所述5'UTR序列或所述3'UTR序列包含核酸内切酶结合位点和/或逆转录酶结合位点，并且其中所述转基因序列被整合到所述免疫细胞的所述基因组中。4.一种将核酸序列整合到细胞的基因组中的方法，所述方法包括引入重组mRNA或编码mRNA的载体，其中所述mRNA包含：(a)插入序列，其中所述插入序列包含(i)外源性序列或(ii)作为所述外源性序列的反向补体的序列；(b)5'UTR序列、所述5'UTR序列下游的人逆转录转座子序列和所述人逆转录转座子序列下游的3'UTR序列；其中所述5'UTR序列或所述3'UTR序列包含核酸内切酶结合位点和/或逆转录酶结合位点，并且其中所述人逆转录转座子序列编码从含有两个ORF的单个RNA翻译的两种蛋白质，并且其中所述插入序列被整合到所述细胞的所述基因组中。5.如权利要求3或4所述的方法，其中所述5'UTR序列或所述3'UTR序列包含ORF2p结合位点。6.如权利要求2或5所述的方法，其中所述ORF2p结合位点是所述3'UTR序列中的多聚A序列。7.如权利要求1
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3中任一项所述的方法，其中所述mRNA包含人逆转录转座子序列。8.如权利要求7所述的方法，其中所述人逆转录转座子序列位于所述5'UTR序列的下游。9.如权利要求7或8所述的方法，其中所述人逆转录转座子序列位于所述3'UTR序列的上游。10.如权利要求7
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9中任一项所述的方法，其中所述人逆转录转座子序列编码从含有两个ORF的单个RNA翻译的两种蛋白质。11.如权利要求4或10所述的方法，其中所述两个ORF是非重叠的ORF。12.如权利要求4、10或11所述的方法，其中所述两个ORF是ORF1和ORF2。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述ORF1编码ORF1p且ORF2编码ORF2p。14.如权利要求4
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13中任一项所述的方法，其中所述人逆转录转座子序列包括非LTR逆转录转座子的序列。15.如权利要求4
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13中任一项所述的方法，其中所述人逆转录转座子序列编码包括LINE
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1逆转录转座子。16.如权利要求15所述的方法，其中所述LINE
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1逆转录转座子是人LINE
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1逆转录转座子。17.如权利要求4
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16中任一项所述的方法，其中所述人逆转录转座子序列包括编码核酸内切酶和/或逆转录酶的序列。18.如权利要求17所述的方法，其中所述核酸内切酶和/或逆转录酶是ORF2p。19.如权利要求17所述的方法，其中所述逆转录酶是II组内含子逆转录酶结构域。20.如权利要求17所述的方法，其中所述核酸内切酶和/或逆转录酶是小须鲸核酸内切酶和/或逆转录酶。21.如权利要求4
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16或20中任一项所述的方法，其中所述人逆转录转座子序列包括编码ORF2p的序列。22.如权利要求21所述的方法，其中使用所述ORF2p的核酸内切酶结构域的特异性将所述插入序列整合到所述基因组的多聚T位点处。23.如权利要求22所述的方法，其中所述多聚T位点包含序列TTTTTA。24.如权利要求4
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23中任一项所述的方法，其中(i)所述人逆转录转座子序列包含编码ORFlp的序列，(ii)所述mRNA不包含编码ORFlp的序列，或(iii)所述mRNA包含将所述编码ORF1p的序列置换为来自补体基因的5'UTR序列。25.如权利要求1
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24中任一项所述的方法，其中所述mRNA包含编码ORF1p的第一mRNA分子和编码核酸内切酶和/或逆转录酶的第二mRNA分子。26.如权利要求1
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24中任一项所述的方法，其中所述mRNA是包含编码ORF1p的第一序列和编码核酸内切酶和/或逆转录酶的第二序列的mRNA分子。27.如权利要求26所述的方法，其中所述编码ORF1p的第一序列与所述编码核酸内切酶和/或逆转录酶的第二序列由接头序列分隔开。28.如权利要求27所述的方法，其中所述接头序列包括内部核糖体进入序列(IRES)。29.如权利要求28所述的方法，其中所述IRES是来自CVB3或EV71的IRES。30.如权利要求27所述的方法，其中所述接头序列编码自切割肽序列。31.如权利要求27所述的方法，其中所述接头序列编码T2A、E2A或P2A序列。32.如权利要求1
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31中任一项所述的方法，其中所述人逆转录转座子序列包含编码与额外蛋白质序列融合的ORF1p的序列和/或编码与额外蛋白质序列融合的ORF2p的序列。33.如权利要求32所述的方法，其中所述ORF1p和/或所述ORF2p与核保留序列融合。34.如权利要求33所述的方法，其中所述核保留序列是Alu序列。35.如权利要求32所述的方法，其中所述ORF1p和/或所述ORF2p与MS2外壳蛋白融合。36.如权利要求1
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35中任一项所述的方法，其中所述5'UTR序列或所述3'UTR序列包含至少一个、两个、三个或更多个MS2发夹序列。37.如权利要求17
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36中任一项所述的方法，其中所述5'UTR序列或所述3'UTR序列包含
促进或增强所述mRNA的多聚A尾与所述核酸内切酶和/或逆转录酶相互作用的序列。38.如权利要求17
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37中任一项所述的方法，其中所述5'UTR序列或所述3'UTR序列包含促进或增强多聚A结合蛋白(PABP)与所述核酸内切酶和/或逆转录酶相互作用的序列。39.如权利要求17
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38中任一项所述的方法，其中所述5'UTR序列或所述3'UTR序列包含相对于由所述细胞表达的另一种mRNA增加所述核酸内切酶和/或逆转录酶对所述mRNA的特异性的序列。40.如权利要求1
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32中任一项所述的方法，其中所述5'UTR序列或所述3'UTR序列包含Alu元件序列。41.如权利要求26
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40中任一项所述的方法，其中所述编码ORF1p的第一序列和所述编码核酸内切酶和/或逆转录酶的第二序列具有相同的启动子。42.如权利要求24
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41中任一项所述的方法，其中所述插入序列具有与所述编码ORF1p的第一序列的启动子不同的启动子。43.如权利要求17
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42中任一项所述的方法，其中所述插入序列具有与所述编码核酸内切酶和/或逆转录酶的第二序列的启动子不同的启动子。44.如权利要求26
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43中任一项所述的方法，其中所述编码ORF1p的第一序列和/或所述编码核酸内切酶和/或逆转录酶的第二序列具有选自以下各项中的启动子或转录起始位点：诱导型启动子、CMV启动子或转录起始位点、T7启动子或转录起始位点、EF1a启动子或转录起始位点及其组合。45.如权利要求1
‑
44中任一项所述的方法，其中所述插入序列具有选自以下各项中的启动子或转录起始位点：诱导型启动子、CMV启动子或转录起始位点、T7启动子或转录起始位点、EF1a启动子或转录起始位点及其组合。46.如权利要求26
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45中任一项所述的方法，其中所述编码ORF1p的第一序列和所述编码核酸内切酶和/或逆转录酶的第二序列被密码子优化以用于在人细胞中表达。47.如权利要求1
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46中任一项所述的方法，其中所述mRNA包含WPRE元件。48.如权利要求1
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47中任一项所述的方法，其中所述mRNA包含选择标志物。49.如权利要求1
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48中任一项所述的方法，其中所述mRNA包含编码亲和标签的序列。50.如权利要求49所述的方法，其中所述亲和标签与所述编码核酸内切酶和/或逆转录酶的序列连接。51.如权利要求1
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50中任一项所述的方法，其中所述3'UTR包含多聚A序列或其中多聚A序列在体外被添加到所述mRNA中。52.如权利要求51所述的方法，其中所述多聚A序列位于编码核酸内切酶和/或逆转录酶的序列的下游。53.如权利要求51或52所述的方法，其中所述插入序列位于所述多聚A序列的上游。54.如权利要求1
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53中任一项所述的方法，其中所述3'UTR序列包含所述插入序列。55.如权利要求1
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54中任一项所述的方法，其中所述插入序列包含作为编码外源性多肽的所述序列的反向补体的序列。56.如权利要求1
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55中任一项所述的方法，其中所述插入序列包含多聚腺苷酸化位点。57.如权利要求1
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56中任一项所述的方法，其中所述插入序列包含SV40多聚腺苷酸化位点。
58.如权利要求1
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57中任一项所述的方法，其中所述插入序列在所述作为编码所述外源性多肽的所述序列的反向补体的序列上游包含多聚腺苷酸化位点。59.如权利要求1
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58中任一项所述的方法，其中所述插入序列在不是核糖体基因座的基因座处整合到所述基因组中。60.如权利要求1
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58中任一项所述的方法，其中所述插入序列整合到基因或基因的调控区中，从而破坏所述基因或下调所述基因的表达。61.如权利要求1
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58中任一项所述的方法，其中所述插入序列整合到基因或基因的调控区中，从而上调所述基因的表达。62.如权利要求1
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58中任一项所述的方法，其中所述插入序列整合到所述基因组中并替换基因。63.如权利要求1
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62中任一项所述的方法，其中所述插入序列被稳定地整合到所述基因组中。64.如权利要求1
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63中任一项所述的方法，其中所述插入序列被逆转录转座到所述基因组中。65.如权利要求1
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64中任一项所述的方法，其中所述插入序列通过由所述mRNA编码的核酸内切酶切割靶位点的DNA链而被整合到所述基因组中。66.如权利要求1
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65中任一项所述的方法，其中所述插入序列通过靶标引发的逆转录(TPRT)而被整合到所述基因组中。67.如权利要求1
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65中任一项所述的方法，其中所述插入序列通过将所述mRNA反向剪接到所述基因组的DNA靶位点中而被整合到所述基因组中。68.如权利要求1或4
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67中任一项所述的方法，其中所述细胞是免疫细胞。69.如权利要求3或68所述的方法，其中所述免疫细胞是T细胞或B细胞。70.如权利要求3或68所述的方法，其中所述免疫细胞是骨髓细胞。71.如权利要求3或68所述的方法，其中所述免疫细胞选自：单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、树突状前体细胞和巨噬细胞前体细胞。72.如权利要求1
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71中任一...

【专利技术属性】
技术研发人员：丹尼尔，
申请(专利权)人：美洛德生物医药公司，
类型：发明
国别省市：