一种猪流行性腹泻病毒感染模型及其构建方法和应用技术

本发明专利技术公开一种猪流行性腹泻病毒感染的动物模型及其构建方法和应用。本发明专利技术将猪流行性腹泻病毒颅内注射方式感染哺乳动物，该模型可模拟病毒在新生猪体内诱导的腹泻症状，可为下一步进行病毒毒力评价、药物的抗病毒治疗和疫苗的免疫保护效果提供研究工具。疫苗的免疫保护效果提供研究工具。

【技术实现步骤摘要】
一种猪流行性腹泻病毒感染模型及其构建方法和应用


[0001]本专利技术涉及一种致病原体感染的动物模型及其构建方法和应用，确切讲本专利技术涉及一种猪流行性腹泻病毒感染小鼠模型及其构建方法和应用。

技术介绍

[0002]猪急流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)是一种猪肠道冠状病毒，可引起呕吐，水样腹泻等临床症状，对新生仔猪致死率可高达95％以上。PEDV可感染不同年龄的猪，但临床症状和致死率随感染猪的年龄而异。2周龄以内仔猪感染PEDV通常发生严重腹泻和高死亡率，但2周龄以上仔猪感染无明显症状。PEDV发现于20世纪70年代，在世界范围内广泛流行，并不断变异，对全球养猪业造成了严重的经济损失。早期流行毒株为基因I型，2010年以来，变异毒株基因II型占据了流行主导地位。目前仅有猪被认定为PEDV的宿主，没有其他动物被发现可感染PEDV，
[0003]由于PEDV仅能感染猪，只诱导2周龄以内吮乳仔猪致病和死亡，相关致病性和免疫学研究均在吮乳仔猪上进行。而用于PEDV致病、免疫研究的吮乳仔猪需要与母猪共同饲养或人工饲喂，大大增加了实验成本和难度。因此，对于PEDV的研究受限于合适的动物模型，尤其是小动物模型的建立，提供科学可靠的PEDV感染模型，为病理学变化、致病机制、免疫机理以及评估治疗药物和疫苗的有效性及安全性提供科学基础。
[0004]迄今为止尚无公开的涉及猪感染PEDV的模型披露。

技术实现思路

[0005]本专利技术提供了一种PEDV感染模型构建方法，同时提供用这一方法获得的动物模型，以及这一模型的用途。
[0006]本专利技术的猪流行性腹泻病毒感染模型的构建方法是：用猪流行性腹泻病毒颅内接种感染小于等于7日龄的哺乳动物，获得，得到猪流行性腹泻病毒感染的动物模型。
[0007]优选地，本专利技术的模型构建方法所述流行性腹泻病毒为PEDV，基因I型和基因II型PEDV毒株均可用于本模型的构建。
[0008]优选地，本专利技术的模型构建方法所述的哺乳动物为小鼠。
[0009]优选地，本专利技术的模型构建方法的接种剂量大于等于102TCID
50
。本专利技术的模型构建方法更优选的接种剂量为102‑
105TCID
50
。本专利技术的模型构建方法最优选接种剂量为105TCID
50
。
[0010]本专利技术的方法可建立一种猪流行性腹泻病毒感染的小鼠模型。
[0011]本专利技术的小鼠模型可用于猪流行性腹泻病毒引起的相关疾病的致病机制和免疫机理研究，也可在制备用于猪流行性腹泻病毒防治药物的应用，或者在备猪流行性腹泻病毒疫苗的应用。
[0012]该方法得到的小鼠模型可模拟PEDV感染新生猪所引起的临床症状，并发生死亡，该模型可模拟病毒在新生猪体内诱导的腹泻症状，可为下一步进行病毒毒力评价、药物的
抗病毒治疗和疫苗的免疫保护效果提供研究工具。因此，本专利技术的方法得到的小鼠模型可用于PEDV的致病机制和免疫机理研究，以及抗病毒药物和疫苗的研发，有助于防控PEDV。
[0013]本专利技术的有益效果是：
①
本专利技术发现只有采用颅内注射流行性腹泻病毒方式感染7日龄以内小鼠，可致死小鼠，并导致小鼠发生腹泻，意外获得了流行性腹泻病毒感染小鼠模型；
②
本专利技术建立的PEDV感染小鼠模型，攻毒后实验小鼠临床症状清晰、典型、可重复性高，与新生猪感染的临床症状一致，可用于PEDV相关疾病的致病机制和免疫机理研究，以及抗病毒药物和疫苗的研发，有助于防控PEDV引起的疾病。
附图说明
[0014]图1为经不同攻毒途径感染PEDV后，小鼠不同脏器的病毒检出量；
[0015]图2为7日龄、14日龄和21日龄小鼠感染PEDV后，不同脏器的病毒检出量；
[0016]图3为7日龄小鼠感染不同剂量PEDV后，各脏器的病毒检出量；
[0017]图4为7日龄小鼠感染PEDV后的症状，其中A为7日龄小鼠感染PEDV后的临床得分，B为7日龄小鼠感染PEDV后的H&E染色切片图；C为7日龄小鼠感染PEDV后的免疫组化图片。
具体实施方式
[0018]以下结合附图和具体实施例来进一步说明本专利技术，但实施例并不对本专利技术做任何形式的限定。除非特别说明，本专利技术采用的试剂、方法和设备为本
常规试剂、方法和设备。除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
[0019]本实验所用小鼠购买自中国农业科学院兰州兽医研究所实验动物中心，所用毒株基因I型CV777(GenBank序列号KT323979.1)为疫苗生产所用毒株，基因II型PEDV LJX01/GS/2014为本实验室分离并保存。
[0020]实施例1PEDV感染小鼠途径的确立
[0021]选择常见实验动物BALB/c小鼠来建立感染免疫模型。采用105TCID
50
剂量的PEDV分别通过颅内注射、腹腔注射和灌胃方式感染7日龄BALB/c小鼠。观察感染后小鼠的症状。
[0022]结果显示：颅内注射小鼠体重下降，发生腹泻，至第7天,LJX01/GS/2014感染小鼠存活率为40％，CV777感染小鼠全部死亡(结果见表1)。腹腔注射和灌胃方式感染的小鼠无明显症状；结果表明：虽然PEDV为肠道病毒，仅能通过感染肠道获得PEDV感染的猪模型，但是本专利技术意外发现，通过颅内注射感染PEDV方式感染7日龄BALB/c小鼠，可成功获得一种PEDV感染的小鼠模型。
[0023]表1不同攻毒途径感染PEDV后小鼠的存活率
[0024][0025]为进一步验证PEDV对小鼠的感染，于感染后第1、3天分别安乐死三只小鼠，取脑、肺、脾、肠、血液，提取总RNA，反转录后以荧光定量PCR方法检测病毒拷贝数。检测所用上游引物序列为GATACTTTGGCCTCTTGTGT；下游引物序列为CACAACCGAATGCTATTGACG；所用探针为FAM
‑
TTCAGCATCCTTATGGCTTGCATC
‑
TAMRA。
[0026]反应体系为：2XTaq，10μL；cDNA，1μL；引物混合物，2μL；混合探针，1μL；ddH2O补平至总体系20μL。
[0027]反应条件为：95℃30s；95℃5s，60℃30s，40个循环；16℃保存。
[0028]结果如图1所示，只有采用颅内注射方式感染小鼠后，小鼠各脏器中PEDV病毒含量显著提高，表明，只有通过颅内注射感染PEDV方式感染7日龄BALB/c小鼠，可成功获得一种PEDV感染的小鼠模型。
[0029]实施例2PEDV感染小鼠日龄的选择
[0030]采用颅内注射方式，将105TCID
50
剂量的PEDV LJX01/GS/2014分别接种7、14、21日龄BALB/c小鼠。结果如表2所示，7日龄小鼠部分死亡，14日龄本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种猪流行性腹泻病毒感染模型的构建方法是：用猪流行性腹泻病毒颅内接种感染小于等于7日龄的哺乳动物，获得，得到猪流行性腹泻病毒感染的动物模型。2.权利要求1或2所述的模型构建方法，其特征在于所用猪流行性腹泻病毒为基因I型或基因II型。3.权利要求1或2所述的模型构建方法，其特征在于所述的哺乳动物为小鼠。4.权利要求3所述的模型构建方法，其特征在于接种剂量大于等于102TCID
50
。5.权利要求4所述的模型构建方法，其特征在于接种剂量为10...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈佳宁，王泽美，邵永恒，陈庆波，刘光亮，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所，
类型：发明
国别省市：