一种检测肿瘤组织中p185蛋白与p95蛋白表达水平的方法技术

本发明专利技术公开了一种检测肿瘤组织中p185蛋白和p95蛋白表达水平的方法，其在不改变现有的肿瘤组织免疫组化分析流程的前提下，通过不同的同位素标记的色原体，在同一张肿瘤组织切片上通过激光解吸飞行时间质谱分别定量检测p185和p95蛋白，从而获取HER2蛋白在肿瘤组织中p185和p95的表达水平。本发明专利技术的有益效果为：本发明专利技术所述检测肿瘤组织中p185蛋白和p95蛋白表达水平的方法解决了现有免疫组化分析方法无法准确检测p185和p95在肿瘤组织中的表达水平的难题，为HER2阳性肿瘤患者的个性化治疗方案提供了有利的科学依据。案提供了有利的科学依据。案提供了有利的科学依据。

【技术实现步骤摘要】
一种检测肿瘤组织中p185蛋白与p95蛋白表达水平的方法


[0001]本专利技术属于生物医药
，具体涉及一种检测肿瘤组织中p185蛋白与p95蛋白表达水平的方法。

技术介绍

[0002]肿瘤细胞膜蛋白
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人类表皮生长因子受体2(human epidermal growth factorreceptor 2，HER2)是一种由ERBB2基因编码的蛋白质。HER2是抗体免疫治疗的主要靶点，也是临床诊断常用的诊断标志物。广泛用于乳腺癌、胃癌和肺癌等癌症的免疫治疗和伴侣诊断。
[0003]HER2是位于肿瘤细胞膜上的跨膜蛋白，分子量为185kDa。临床分析对肿瘤组织切片进行HER2蛋白表达水平的检测，对判定患者是否患有HER2高表达的肿瘤类型至关重要(即，患者是否为HER2阳性)。对HER2蛋白表达水平较高的患者，临床治疗可采用曲妥珠单抗(曲妥珠单抗是一种针对HER2的单克隆抗体)。曲妥珠单抗识别和结合HER2蛋白位于细胞膜外的靠近HER2蛋白N
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terminal的肽段序列。现有的免疫组化分析技术，包括磁微粒化学发光分析方法、磁微粒流式荧光分析方法及酶联免疫吸附分析方法。这些方法均采用HER2抗体特异性地识别HER2位于细胞膜内的靠近HER2蛋白C
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terminal的肽段序列。
[0004]临床医学研究发现，HER2蛋白在肿瘤组织的表达出现了异质性，包括分子量为185kDa的完整HER2蛋白(即，p185)和失去部分N
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terminal的分子量为95kDa的碎片HER2蛋白(即，p95)。尤为重要的是p95，HER2蛋白失去了位于N
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terminal的与曲妥珠单抗结合的肽段序列，因此对p95 HER2蛋白高表达水平的患者进行曲妥珠单抗免疫治疗不会产生任何临床治疗效果。虽然现有的组织免疫组化分析可以通过识别位于HER2蛋白C
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terminal的肽段序列而有效地检测到HER2蛋白在肿瘤组织的表达水平，从而判定患者是否为HER2阳性的肿瘤类型，但是无法判断患者的HER2表达水平是来自于完整HER2蛋白(即，p185)，还是来自于碎片HER2蛋白(即，p95)，或者HER2表达水平是来自与p185与p95的加合。因此，建立一种精准原位定量检测肿瘤组织中完整HER2蛋白与碎片HER2蛋白含量的分析技术可以准确检测肿瘤组织中完整HER2蛋白(p185)与碎片HER2蛋白(p95)的表达水平，这对临床上是否对HER2阳性患者采用曲妥珠单抗免疫治疗具有极其重要的指导意义。

技术实现思路

[0005]本申请的主要目的在于提供一种在不改变现有的肿瘤组织免疫组化分析流程的前提下，通过不同的同位素标记的色原体，在同一张肿瘤组织切片上通过激光解吸飞行时间质谱分别定量检测p185和p95蛋白，从而获取HER2蛋白在肿瘤组织中p185和p95的表达水平，为制定个性化的曲妥珠单抗免疫治疗方案提供科学依据的精准原位检测肿瘤组织中完整HER2蛋白(p185)与碎片HER2蛋白(p95)含量的定量分析方法。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
[0007]一种检测肿瘤组织中p185蛋白和p95蛋白表达水平的方法，包括以下步骤：
[0008](1)向肿瘤组织切片上加入兔单抗识别p95蛋白，孵育，使待测抗原p95与初级抗体结合，使用漂洗液浸洗肿瘤组织切片除去多余的初级抗体；
[0009](2)在步骤(1)所得肿瘤组织切片上加入碱性磷酸酶，孵育；使初级抗体与二级抗体结合，然后使用漂洗液浸洗肿瘤组织切片，再在肿瘤组织切片上加入萘酚磷酸盐和非同位素标记的色原体，孵育，实现对肿瘤组织切片中p95抗原的原位检测；
[0010](3)使用冲洗液浸洗步骤(2)所得肿瘤组织切片，再使用漂洗液浸洗，然后在肿瘤组织切片上加入兔单抗识别p185蛋白，孵育，使待测抗原p185与初级抗体结合,使用漂洗液浸洗肿瘤组织切片除去多余的初级抗体；
[0011](4)在步骤(3)所得肿瘤组织切片上加入碱性磷酸酶，孵育；使初级抗体与二级抗体结合，然后使用漂洗液浸洗肿瘤组织切片，再在肿瘤组织切片上加入萘酚磷酸盐和同位素标记的色原体，孵育，实现对肿瘤组织切片中p185抗原的原位检测；
[0012](5)使用冲洗液浸洗步骤(4)所得肿瘤组织切片，再使用漂洗液浸洗。
[0013]本专利技术所述检测肿瘤组织中p185蛋白和p95蛋白表达水平的方法，在不改变现有的肿瘤组织免疫组化分析流程的前提下，通过不同的同位素标记的色原体，在同一张肿瘤组织切片上通过激光解吸飞行时间质谱分别定量检测p185和p95蛋白，从而获取HER2蛋白在肿瘤组织中p185和p95的表达水平，并制定个性化的曲妥珠单抗免疫治疗方案提供科学依据。
[0014]兔单抗指兔单克隆抗体(RabMAbs)：新一代单克隆抗体用于科研、诊断和治疗，兔单抗技术通过用高质量兔单抗来替换多抗或低亲合力鼠单抗产品，来改进难以复制的诊断产品。兔单克隆抗体的出现带来了许多好处。首先，兔抗血清通常含有高亲合力抗体，可以比鼠抗血清识别更多种类的表位。其次，兔单克隆抗体能够以识别许多在小鼠中不产生免疫的抗原。第三，由于兔脾脏较大，可以进行更多的融合实验，使得高通量筛选融合细胞成为可能。
[0015]上述一种检测肿瘤组织中p185蛋白和p95蛋白表达水平的方法，作为一种优选的实施方案，所述肿瘤组织切片为乳腺癌、胃癌、肺癌、结直肠癌或食管癌肿瘤组织切片。
[0016]上述一种检测肿瘤组织中p185蛋白和p95蛋白表达水平的方法，作为一种优选的实施方案，步骤(1)
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步骤(4)中，所述孵育均为在温度为37℃的条件下，静置10
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15min。
[0017]上述一种检测肿瘤组织中p185蛋白和p95蛋白表达水平的方法，作为一种优选的实施方案，步骤(1)
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步骤(5)中，所述漂洗液为含有1x PBS和0.1％Tween
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20的水溶液。
[0018]上述一种检测肿瘤组织中p185蛋白和p95蛋白表达水平的方法，作为一种优选的实施方案，步骤(2)和步骤(4)中，萘酚磷酸盐的浓度为10mM，同位素标记的色原体的浓度为5mM。
[0019]上述一种检测肿瘤组织中p185蛋白和p95蛋白表达水平的方法，作为一种优选的实施方案，步骤(3)和步骤(5)中，所述冲洗液为含有25mM甘氨酸、1％SDS的水溶液。
[0020]上述一种检测肿瘤组织中p185蛋白和p95蛋白表达水平的方法，作为一种优选的实施方案，所述肿瘤组织为新鲜冷冻肿瘤组织或FFPE肿瘤组织。
[0021]FFPE肿瘤组织为石蜡包埋的肿瘤组织。
[0022]本专利技术的有益效果为：本专利技术所述检测肿瘤组织中p185蛋白和p95蛋白表达水平的方法，在不改变现有的肿瘤组织免疫组化分析流程的前提下，通过不同的同位素本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测肿瘤组织中p185蛋白和p95蛋白表达水平的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)用漂洗液浸洗肿瘤组织切片，再向肿瘤组织切片上加入兔单抗识别p95蛋白，孵育，使待测抗原p95与初级抗体结合，使用漂洗液浸洗肿瘤组织切片除去多余的初级抗体；(2)在步骤(1)所得肿瘤组织切片上加入碱性磷酸酶，孵育；使初级抗体与二级抗体结合，然后使用漂洗液浸洗肿瘤组织切片，再在肿瘤组织切片上加入萘酚磷酸盐和非同位素标记的色原体，孵育，实现对肿瘤组织切片中p95抗原的原位检测；(3)使用冲洗液浸洗步骤(2)所得肿瘤组织切片，再使用漂洗液浸洗，然后在肿瘤组织切片上加入兔单抗识别p185蛋白，孵育，使待测抗原p185与初级抗体结合,使用漂洗液浸洗肿瘤组织切片除去多余的初级抗体；(4)在步骤(3)所得肿瘤组织切片上加入碱性磷酸酶，孵育；使初级抗体与二级抗体结合，然后使用漂洗液浸洗肿瘤组织切片，再在肿瘤组织切片上加入萘酚磷酸盐和同位素标记的色原体，孵育，实现对肿瘤组织切片中p185抗原的原位检测；(5)使用冲洗液浸洗步骤(4)所得肿瘤组织切片，再使用漂洗液浸洗。2.根据权利要求1所述的检测肿瘤组织中p185蛋白和p95蛋白表达水平的方法，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：高俊顺，高俊莉，王洪，江南，凌欢君，
申请(专利权)人：杭州广科安德生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：