降解菲的复合菌群及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及降解菲的复合菌群及其筛选方法和应用。本发明专利技术提供的降解菲的复合菌群包括假单胞菌属、短波单胞菌属、斯克尔曼氏菌属、根瘤菌属、玫瑰单胞菌属和鞘氨醇单胞菌属，可稳定快速的降解菲，有效用于菲的生物降解与环境修复。与现有技术相比，本发明专利技术可以在去除菲的同时保留基本的微生物生态交互网络，从而保持菌群的稳定性，菌群可以在污染土壤中更长时间存在，保持长时间的降解效果。保持长时间的降解效果。

【技术实现步骤摘要】
降解菲的复合菌群及其制备方法和应用


[0001]本专利技术属于生物
，特别涉及降解菲的复合菌群及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]多环芳烃(PAHs)是环境中普遍存在的有机污染物，对人类健康存在巨大的威胁。大部分的多环芳烃对人具有致畸性和致癌性。同时多环芳烃在环境中具有快速的移动性，从而使其在空气、土壤、水环境、沉淀物等环境介质中广泛分布。PAHs主要来自于焦化厂、炼钢厂、化工厂等排放的废弃物，石油等燃料的不完全燃烧，垃圾的焚烧和填埋，飞机、汽车等交通工具所排放的废气等。土壤是最容易发生PAHs积累的介质。文献表明环境中90％以上的PAHs积聚在土壤中。2014年《全国土壤污染状况调查公报》中显示工业废弃地、化工类园区、重污染企业用地、采油区、污水灌溉区及其周边土壤己成为PAHs的主要污染区域。我国土壤中PAHs污染点位超标率为1.4％，而中重度污染点位超标率为0.4％。PAHs进入土壤后，会将土壤的孔间隙封堵，降低土壤的透水性和透气性，抑制微生物的生长，进一步抑制农作物的生长。
[0003]菲(PHE)是多环芳烃的典型代表物质，菲是一种低分子量的多环芳烃，其结构中具有一个“Bay
‑
区域”和一个“K
‑
区域"，这两个结构与致癌性密切相关。环境中的菲多以固态形式存在，会在环境中长期停留并通过食物链向人体富集。在土壤中，菲也多以固态存在，而其主要来源是含菲废气的沉降以及将含有菲的垃圾等直接以肥料施于农田。有研究对某焦化厂土壤中的PAHs分布进行研究后发现，其中菲的浓度达到了83.7
±
10.6mg/kg。由于以菲为代表的多环芳烃对于人类健康存在直接和间接的威胁，因此需要采用一定的措施来减少其带来的风险，尤其是减少其在土壤中的污染。
[0004]近年来用于修复污染土壤中多环芳烃的方法包括物理修复方法、化学修复方法和生物修复方法，但前两者有可能会对环境造成二次污染或者成本高昂。生物修复方法作为一种更加安全且低成本的污染物修复措施，已经被应用于污染土壤或者污染水源的修复。从20世纪60年代发现第一株可以降解多环芳烃的假单胞菌以来，已经发现了多株具有多环芳烃降解能力的细菌，包括伯克霍尔德氏菌、假单胞菌、分枝杆菌、鞘氨醇单胞菌等。其中现有研究表明，假单胞菌是一类能够有效地降解PAHs的细菌。在公开号CN101195811A的专利申请中报道了一株对菲和萘有厌氧降解效果的假单胞菌。鞘氨醇单胞菌也是一类对污染物有降解效果的细菌。在公开号CN1844361A的专利申请中涉及一种由鞘氨醇单胞菌属菌株组成的降解多环芳烃的菌剂。除了降解功能菌外，还有一些菌株通过产生营养物质、降解有毒副产物或者与入侵菌株拮抗等过程提高整个菌群的稳定性。如Methylorubrum extorquens可以分解木质素降解中产生的具有毒害作用的甲醇，使降解菌持续发挥作用。
[0005]尽管能够降解多环芳烃的细菌比较多，但几乎都是利用单一细菌进行降解。如中国专利CN110699294B就公布了一株降解多环芳烃的菌株。而生物降解在实际修复中面临着环境变化的影响，单一细菌很容易受到环境的影响而难以发挥预期的功能。但是不同菌株可以通过相互作用从而形成复杂、稳定的生态交互网络，在面对环境胁迫时，相比单一菌株
有更强的抗压能力和自我恢复能力。
[0006]因此需要开发一种具有高环境适应性的复合菌群，更好地定植于复杂的土壤环境中，更高效地降解土壤中的以菲为代表的多环芳烃类污染物。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的是提供一种降解菲的复合菌群及其制备方法和应用，该菌群可稳定快速的降解菲，可有效用于菲的生物降解与环境修复。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0008]一方面，本专利技术提供复合菌群，其特征在于，所述复合菌群包括假单胞菌属、短波单胞菌属、斯克尔曼氏菌属、根瘤菌属、玫瑰单胞菌属和鞘氨醇单胞菌属。
[0009]在一些实施方案中，所述复合菌群按菌液体积比包括假单胞菌属90.35％
‑
95.53％、短波单胞菌属0.54％
‑
1.05％、斯克尔曼氏菌属0.31％
‑
6.97％、根瘤菌属0.08％
‑
1.13％、玫瑰单胞菌属0.01％
‑
1.28％和鞘氨醇单胞菌属0.0108％
‑
0.0236％。
[0010]在一些实施方案中，所述复合菌群包括恶臭假单胞菌90.35％
‑
95.53％、土壤短波单胞菌0.54％
‑
1.05％、抗锑斯克尔曼氏菌0.31％
‑
6.97％、根瘤菌0.08％
‑
1.13％、颈玫瑰单胞菌0.01％
‑
1.28％和多噬香鞘氨醇单胞菌0.0108％
‑
0.0236％。
[0011]另一方面，本专利技术降解菲的复合菌群的筛选方法，其特征在于，包括：以受原油污染的土壤为样品，采用含有菲的无机盐培养基进行富集培养，而后通过梯度稀释的方法逐渐分离出降解菲的目的复合菌群，以目的复合菌群DNA为模版，选择16S rRNA V3
‑
V4区域进行扩增，引物为27F
‑5’‑
AGAGTTTGATCCTGGCTCAG
‑3’
和1492R
‑5’‑
TACGACTTAACCCCAATCGC
‑3’
，对复合菌群的群落结构进行分析。
[0012]在一些实施方案中，受原油污染的土壤的原油含量≥200mg
·
kg
‑1。
[0013]在一些实施方案中，菲无机盐培养基(PHE
‑
MSM)的配制方法为：先配制无机盐培养基，分装后灭菌，再在无菌环境中加入无菌菲储备液，放置于培养箱中，以挥发尽其中的丙酮；
[0014]无机盐培养基的配方为：NaNO
3 0.5g
·
L
‑1、KH2PO
4 1.0g
·
L
‑1、CaC1
2 0.02g
·
L
‑1、MgSO
4 0.2g
·
L
‑1、(NH4)2SO
4 0.5g
·
L
‑1、NaH2PO
4 1.0g
·
L
‑1、FeSO4·
7H2O 0.001g
·
L
‑1；2mL微量元素溶液；
[0015]微量元素溶液配方为：MoO
3 0.001g
·
L
‑1、ZnSO4·
7H2O 0.007g
·
L
‑1、CuSO4·
5H2O 0.0005g
·
L
‑1、H3BO
3 0.001g
·
L
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.复合菌群，其特征在于，所述复合菌群包括假单胞菌属、短波单胞菌属、斯克尔曼氏菌属、根瘤菌属、玫瑰单胞菌属和鞘氨醇单胞菌属。2.根据权利要求1所述的复合菌群，其特征在于，所述复合菌群包括假单胞菌属90.35％
‑
95.53％、短波单胞菌属0.54％
‑
1.05％、斯克尔曼氏菌属0.31％
‑
6.97％、根瘤菌属0.08％
‑
1.13％、玫瑰单胞菌属0.01％
‑
1.28％和鞘氨醇单胞菌属0.0108％
‑
0.0236％。3.根据权利要求1或2所述的复合菌群，其特征在于，所述复合菌群按单菌菌悬液体积比包括恶臭假单胞菌90.35％
‑
95.53％、土壤短波单胞菌0.54％
‑
1.05％、抗锑斯克尔曼氏菌0.31％
‑
6.97％、根瘤菌0.08％
‑
1.13％、颈玫瑰单胞菌0.01％
‑
1.28％和多噬香鞘氨醇单胞菌0.0108％
‑
0.0236％。4.降解菲的复合菌群的筛选方法，其特征在于，包括：以受原油污染的土壤为样品，采用含有菲的无机盐培养基进行富集培养，而后通过梯度稀释的方法逐渐分离出降解菲的目的复合菌群，以目的复合菌群DNA为模版，选择16S rRNA V3
‑
V4区域进行扩增，引物为27F
‑5’‑
AGAGTTTGATCCTGGCTCAG
‑3’
和1492R
‑5’‑
TACGACTTAACCCCAATCGC
‑3’
，对复合菌群的群落结构进行分析。5.根据权利要求4所述的降解菲的复合菌群的筛选方法，其特征在于，受原油污染的土壤的原油含量≥200mg
·
kg
‑1。6.根据权利要求4或5所述的降解菲的复合菌群的筛选方法，其特征在于，菲无机盐培养基(PHE
‑
MSM)的配制方法为：先配制无机盐培养基，分装后灭菌，再在无菌环境中加入无菌菲储备液，放置于培养箱中，以挥发尽其中的丙酮；无机盐培养基的配方为：NaNO
3 0.5g
·
L
‑1、KH2PO
4 1.0g
·
L
‑1、CaC120.02g
·...

【专利技术属性】
技术研发人员：马安周，梁宇，庄国强，
申请(专利权)人：中国科学院生态环境研究中心，
类型：发明
国别省市：