一种大肠杆菌培养基及培养方法技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，尤其涉及一种大肠杆菌培养基及培养方法。本发明专利技术培养基由胰蛋白胨、酵母提取物、氯化钠、磷酸氢二钠和磷酸二氢钾按照特定比例组成。实验表明，本发明专利技术培养基可以显著提高大肠杆菌工程菌在增殖生长过程中质粒DNA的产量和质粒DNA菌比含量，效果明显优于现有的培养基。显优于现有的培养基。

【技术实现步骤摘要】
一种大肠杆菌培养基及培养方法
优先权声明
[0001]本申请要求2021年3月2日提交的申请号为202110230492.3的中国专利申请的优先权，所述申请以全文引用的方式并入本文中。


[0002]本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种大肠杆菌培养基及培养方法。

技术介绍

[0003]质粒属于环形双链DNA，具有自主复制能力，使其在子代细胞中也能保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息。随着近年来重组DNA技术和基因组测序的发展，质粒DNA作为一种可携带外源基因的非病毒转基因载体，可作为基因治疗和基因疫苗的生物药剂。质粒DNA作为主要的药物载体，其优点是安全可靠、稳定、对外源基团的容纳量大、无载体免疫原性及易于生产等。
[0004]在基因治疗中，与病毒载体相比，质粒DNA载体转染细胞的效率较低，持续时间短，若要质粒DNA能够高效表达治疗疾病，其临床用量需达到mg级。目前，一般在质粒DNA的生产中都采用发酵罐发酵的方法来提高质粒DNA总产量，而发酵法通常是通过优化菌的生长情况，提高每升培养基的菌体量来提高质粒DNA产量。在质粒DNA在临床上的应用中，宿主基因组DNA、RNA、宿主蛋白和内毒素的含量对于质粒DNA的转染效率有极大的影响，因此，单纯提高每升培养基的菌体量会对后续的质粒分离和纯化流程带来更大的挑战。
[0005]在质粒DNA的生产中，对于大肠杆菌工程菌而言，培养基组分的不同会启动大肠杆菌工程菌胞内不同的代谢途径。不同于蛋白质，质粒DNA是由糖
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磷酸骨架和含氮的核苷酸(ATGC)组成，主要组成元素是C、H、O、P、N，目前质粒DNA生产多采用的是蛋白质工程菌的发酵培养基，该类培养基并不是质粒DNA的最佳培养基，普遍存在质粒DNA的菌比含量较低的问题。

技术实现思路

[0006]有鉴于此，本专利技术提供了一种培养大肠杆菌的培养基及培养方法。本专利技术培养基可有效地促进大肠杆菌工程菌的生长，提高质粒DNA的菌比含量，效果明显优于现有的其他培养基。
[0007]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0008]本专利技术提供一种培养大肠杆菌的培养基，包括水和如下组分：
[0009]本专利技术针对大肠杆菌工程菌生长和质粒DNA复制所需的营养物质对培养基中的胰蛋白胨的浓度、酵母提取物浓度进行了优化，通过优化培养基中的营养物质达到一个平衡状态(胰蛋白胨8.0
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20g/L，酵母提取物19.0
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35g/L)同时满足了大肠杆菌工程菌生长以及质粒DNA复制的需求平衡。
[0010]一个具体实施例中，比较了同一大肠杆菌工程菌在不同培养基中相同培养条件下培养后菌液的OD600值、质粒抽提浓度和质粒DNA的菌比含量，并对质粒DNA的纯度进行了分析。结果显示，本专利技术培养基可以提高大肠杆菌工程菌胞内的质粒DNA含量，对大肠杆菌工程菌生长具有明显促进作用，明显优于其他培养基的培养效果。
[0011]在一些实施方案中，所述培养基包括水和如下组分：养基包括水和如下组分：
[0012]在一些具体实施例中，所述培养基包括水和如下组分：
[0013]在一些具体实施例中，所述培养基包括水和如下组分：
[0014]在一些具体实施例中，所述培养基包括水和如下组分：
[0015]在一些具体实施例中，所述培养基包括水和如下组分：
[0016]在一些实施方案中，本专利技术所述培养基还包括抗生素。添加抗生素的作用在于筛选能够表达抗性基因的大肠杆菌工程菌，成功转化外源质粒DNA。
[0017]在一些实施方案中，所述抗生素的浓度为30
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150μg/mL。在一些实施方案中，所述抗生素的浓度为50
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100μg/mL。在一些实施方案中，所述抗生素的浓度为30μg/mL、40μg/mL、50μg/mL、60μg/mL、70μg/mL、80μg/mL、90μg/mL、100μg/mL、110μg/mL、120μg/mL、130μg/mL、140μg/mL、150μg/mL。在一些实施方案中，所述抗生素的浓度为50μg/mL。在一些实施方案中，所述抗生素的浓度为100μg/mL。
[0018]在一些实施方案中，所述抗生素的种类为本领域技术人员熟知的种类即可，包括但不仅限于氨苄青霉素或卡那霉素，本领域技术人员可根据外源质粒DNA携带的抗性基因选择对应的抗生素种类进行添加。
[0019]在一些具体实施例实施中，所述抗生素为氨苄青霉素。
[0020]在一些实施方案中，本专利技术所述培养基的pH为6.8～7.2。在一些实施方案中，本专利技术所述培养基的pH为6.8。在一些实施方案中，本专利技术所述培养基的pH为7.0。在一些实施方案中，本专利技术所述培养基的pH为7.2。
[0021]本专利技术还提供了大肠杆菌的培养方法，将大肠杆菌单菌落或大肠杆菌菌液接种至本专利技术所述的培养基中培养。
[0022]在一些实施方案中，所述大肠杆菌为大肠杆菌工程菌。根据外源质粒DNA携带的抗性基因，在本专利技术培养基中添加相应的抗生素，从而实现对大肠杆菌工程菌的增殖培养。
[0023]在一些实施方案中，所述培养为37℃，200
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300rpm培养。
[0024]本专利技术培养基包括水和如下组分：胰蛋白胨8.0～20.0g/L、酵母提取物19.0～35.0g/L、氯化钠0.0～10.0g/L、磷酸氢二钠或磷酸氢二钾3.0～15.0g/L、磷酸二氢钾2.0～5.0g/L、蔗糖2.5～8.0g/L。实验表明，本专利技术培养基可以显著提高大肠杆菌工程菌在增殖生长过程中质粒DNA的产量和质粒DNA菌比含量，同时保证了质粒DNA具有较高纯度，效果明显优于现有的培养基。
[0025]如本文所用，术语“质粒”指细菌、酵母菌和放线菌等生物中染色体(或拟核)以外的DNA分子，存在于细胞质中，具有自主复制能力，使其在子代细胞中也能保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息，是闭合环状的双链DNA分子。
[0026]术语“胰蛋白胨”又称胰酪蛋白胨(Casein Tryptone)、胰酶消化酪蛋白胨(Pancreatic digest of casein)，是一种优质蛋白胨，浓缩干燥而成的浅黄色粉末。含有丰富的氮源、氨基酸等，可配制各种微生物培养基，用于细菌的培养、分离、增殖、鉴定，以及无菌试验培养基、厌氧菌培养基等细菌生化特性试验用培养基的配置。
[0027]术语“酵母提取物”又称酵母味素，根据国际通用用法，将其缩写为YE。主要成分为多肽、氨基酸、呈味核苷酸、B族维生素及微量元素，是最为理想的生物培养基原料和发酵工业中的主要原料，其功效与8倍的酵母相当，可以大大提高菌种的生产速率及发酵产品得率。
[0028]术语“蔗糖”是一种双糖，晶体白色，具有旋光性，但无变旋。易被酸水解，水解后产生等量的D
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葡萄糖和D
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果糖。
[0029]术本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种培养大肠杆菌的培养基，其特征在于，包括水和如下组分：胰蛋白胨 8.0～20g/L；酵母提取物 19.0～35g/L；氯化钠 0.0～10.0g/L；磷酸氢二钠或磷酸氢二钾 3.0～15.0g/L；磷酸二氢钾 2.0
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5.0g/L；蔗糖 2.5～8.0g/L。2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，包括水和如下组分：胰蛋白胨 10.0～20g/L；酵母提取物 24.0～35g/L；氯化钠 5.0～10.0g/L；磷酸氢二钠或磷酸氢二钾 7.0～12.5g/L；磷酸二氢钾 3.0
‑
5.0g/L；蔗糖 2.5～8.0g/L。3.根据权利要求1或2所述的培养基，其特征在于，包括水和如下组分：胰蛋白胨 约12.0g/L；酵母提取物 约24.0g/L；氯化钠 约5.0g/L；磷酸氢二钠 约7.0g/L；磷酸二氢钾 约5.0g/L；蔗糖 约8.0g/L。4.根据权利要求1或2所述的培养基，其特征在于，包括水和如下组分：胰蛋白胨 约20.0g/L；酵母提取物 约35.0g/L；氯化钠 约5.0g/L；磷酸氢二钾 约12.5g/L；磷酸二氢钾 约5.0g/L；蔗糖 约2.5g/L。5.根据权利要求1或2所述的培养基，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：臧颖，孟庆伟，闵静，南放，刘辉，胡肖，陶聪琦，张雨婷，
申请(专利权)人：南京金斯瑞生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：