采用氧化碳纳米角猝灭荧光探针对蛋白激酶A检测方法技术

本发明专利技术涉及采用氧化碳纳米角猝灭荧光探针对蛋白激酶A检测方法。该方法是一种简便、快速的蛋白激酶A鉴定和检测方法，利用氧化碳纳米角的猝灭效应，联合羧肽酶和荧光探针进行蛋白激酶A检测，氧化碳纳米角结构稳定，可发生明显的猝灭反应。并且，该方法对人体及环境无危害，具有特异性好、准确性好、操作简单、更加快捷的优点，对于临床应用所需要的高速检测有较好的帮助，该方法对很多疾病的有效诊断和治疗至关重要，解决了现有的技术难点。解决了现有的技术难点。解决了现有的技术难点。

【技术实现步骤摘要】
采用氧化碳纳米角猝灭荧光探针对蛋白激酶A检测方法


[0001]本专利技术属于临床监测
，尤其涉及一种采用氧化碳纳米角猝灭荧光探针对蛋白激酶A检测方法。

技术介绍

[0002]蛋白激酶A，简称PKA，是一个全酶(holoenzyme，由许多次单位组成，是完整的且有作用的酶)，它包含了两个调控次单位以及两个代谢次单位。当细胞中的cAMP较少时，PKA虽然会暂时失去活性，但仍然可以保持结构完整。当cAMP浓度增加，cAMP会接上位于两个调控次单位上的活性区(Binding site)，并使蛋白激酶A的构形改变，进而将两个代谢次单位释放。自由的代谢次单位，则可以参与一些化学反应。
[0003]蛋白激酶参与多种细胞功能，包括新陈代谢、细胞周期调节、生存和分化。蛋白激酶调节失调与多种致癌过程有关。在哺乳动物中，环磷酸腺苷(CAMP)是细胞内的第二信使，通常由激素和神经递质与G蛋白偶联受体(GPCRs)结合而产生。CAMP通过激活cAMP依赖的蛋白激酶A(PKA)发挥许多生理作用，PKA反过来磷酸化并调节下游蛋白靶标的功能，包括离子通道、酶和转录因子。蛋白激酶超家族约占人类基因组的2％，包括至少500种激酶。这些激酶负责在约18000蛋白质中的17万多个非冗余磷酸化位点。除此之外，蛋白激酶活性或特异性通常还与糖尿病、阿尔茨海默病、再狭窄、免疫缺陷、内分泌紊乱或心血管疾病等严重疾病密切相关。在哺乳动物中，环磷酸腺苷(CAMP)是细胞内的第二信使，通常由激素和神经递质与G蛋白偶联受体(GPCRs)结合而产生。CAMP通过激活cAMP依赖的蛋白激酶(PKA)发挥许多生理作用，PKA反过来磷酸化并调节下游蛋白靶标的功能，包括离子通道、酶和转录因子。CAMP/PKA信号通路在多个水平上调节葡萄糖稳态，包括胰岛素和胰高血糖素的分泌、葡萄糖摄取、糖原合成和分解、糖异生以及神经调控葡萄糖稳态。
[0004]据估计，有超过25％的药物开发工作是针对蛋白激酶抑制剂的开发。蛋白激酶A(PKA)是一种典型的嗜碱性丝氨酸/苏氨酸激酶。其在癌细胞异常增殖中起关键作用，它在许多癌细胞或组织(如黑素瘤、肺癌或乳腺癌)中特别亢奋活跃。因此，PKA活性监测对癌症诊断有着重要作用。因此，蛋白激酶调节成为治疗疾病的关键领域之一。
[0005]然而，传统的蛋白激酶A活性检测方法可大致归结为如下几类。首先是放射性标记技术,曾是蛋白激酶A活性分析的标准方法。由于存在放射性污染问题,对人体及环境都存在一定危害，因此虽尚有一些应用，但正逐渐被其它技术所取代。除此之外还有基于抗体的识别技术。主要是利用对特定磷酸化氨基酸位点具有特异性识别能力的亲和抗体,结合荧光、光散射、电化学及比色等各种检测技术，是当前蛋白激酶A活性分析领域最为热门的研究方向。现有的检测蛋白激酶A的检测方法存在特异性不好、准确性不够、操作复杂、检测时间长、对人体及环境存在危害等缺陷。
[0006]因此，建立一种简便、快速的蛋白激酶A鉴定和检测方法对很多疾病的有效诊断和治疗至关重要。

技术实现思路

[0007]鉴于现有技术所存在的问题，本专利技术提供一种采用氧化碳纳米角猝灭荧光探针对蛋白激酶A检测方法。利用氧化碳纳米角的猝灭效应，联合羧肽酶和荧光探针进行蛋白激酶A检测，氧化碳纳米角结构稳定，可发生明显的猝灭反应。并且，该方法对人体及环境无危害，具有特异性好、准确性好、操作简单、更加快捷的优点，对于临床应用所需要的高速检测有较好的帮助，该方法对很多疾病的有效诊断和治疗至关重要，解决了现有的技术难点。
[0008]本专利技术解决上述技术问题的技术方案如下：
[0009]一种荧光探针的制备方法，包括以下步骤：苹果酸熔化，冷却，与氢氧化钠溶液混合，蒸发，制备碳量子点cCQD，将碳量子点cCQD与多肽段溶液孵育，制备荧光探针。
[0010]采用上述技术方案的有益效果包括：采用上述方法制备的荧光探针具有特异性好、准确性好、安全无毒、无污染、对人体及环境无害、合成简便以及材料易获得等优点。
[0011]进一步，多肽段溶液中的多肽段的序列包括5'
‑
NH2
‑
LRRASLG
‑3′
。
[0012]采用上述技术方案的有益效果包括：该序列可被蛋白激酶A磷酸化，并且该肽段含有带正电荷的精氨酸基团，能够更好的通过静电作用吸附到氧化碳纳米角上发生猝灭反应。
[0013]进一步，多肽的序列包括SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。
[0014]进一步，苹果酸与氢氧化钠的质量比例为12:1；将苹果酸在200℃加热直到熔化将温度保持在200℃35min，然后冷却至室温；氢氧化钠溶液中氢氧化钠的浓度为0.25M，与氢氧化钠溶液混合后，调整pH值至5.5
‑
7.5；蒸发采用旋蒸仪在40℃条件下蒸发至100mL；孵育过程中，碳量子点cCQD与多肽段溶液等体积孵育，多肽段溶液的浓度为40μm，孵育的条件为25℃孵育2h。
[0015]优选地，与氢氧化钠混合后，调整pH值为6.0。
[0016]采用上述技术方案的有益效果包括：当pH为5.5
‑
7.5之间可获得较好的荧光强度，当调整pH值为6.0荧光强度更好。严格控制苹果酸和氢氧化钠的比例有助于碳量子点的PH值的稳定性，控制蒸发温度防止温度过高或过低对碳量子点的荧光强度造成影响，孵育时间2h可确保碳量子点与多肽适配体结合成功。
[0017]本专利技术提供一种氧化碳纳米角的制备方法，包括以下步骤：将碳纳米角、N,N
‑
二甲基甲酰胺、发烟硝酸混合，搅拌，回流；降温，去除上清液后加入蒸馏水混匀，离心，反复重复上述水洗操作，直至pH＝7。
[0018]采用上述技术方案的有益效果包括：采用上述方法制备的氧化碳纳米角结构稳定，可发生明显的猝灭反应、对蛋白激酶A检测具有特异性好、准确性好等优点。
[0019]进一步，混合时加入材料的顺序为碳纳米角、N,N
‑
二甲基甲酰胺、发烟硝酸；碳纳米角、N,N
‑
二甲基甲酰胺、发烟硝酸的质量体积比为4g：4mL：4mL；回流的条件为：140℃油浴锅中搅拌回流24h，之后降温至室温；离心的条件为13000rpm离心10min。
[0020]采用上述技术方案的有益效果包括：加入材料的顺序为碳纳米角、N,N
‑
二甲基甲酰胺、发烟硝酸，采用这样的顺序有利于防止加入发烟硝酸后出现反应体系温度过高，出现爆沸情况。碳纳米角、N,N
‑
二甲基甲酰胺、发烟硝酸的质量体积比为4g：4mL：4mL，采用这样的比例有利于在制备完成水洗过过程中保留较多的氧化碳纳米角。回流条件为140℃油浴锅中搅拌回流24h，之后降温至室温是因为温度过高无法进行离心、分离上清液和水洗等操
作。离心的条件为13000rpm离心10min，有利于分析反应过后残留在上清液的液体，得到较为纯净的氧化碳纳米角固体。
[0021]本专利技术提本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种荧光探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：苹果酸熔化，冷却，与氢氧化钠溶液混合，蒸发，制备碳量子点cCQD，将碳量子点cCQD与多肽段溶液孵育，制备荧光探针。2.根据权利要求1所述荧光探针的制备方法，其特征在于，多肽段溶液中的多肽段的序列包括5'
‑
NH2
‑
LRRASLG
‑3′
。3.根据权利要求1或2所述荧光探针的制备方法，其特征在于，苹果酸与氢氧化钠的质量比例为12:1；将苹果酸在200℃加热直到熔化将温度保持在200℃35min，然后冷却至室温；氢氧化钠溶液中氢氧化钠的浓度为0.25M，与氢氧化钠溶液混合后，调整pH值至5.5
‑
7.5,优选地pH值为6.0；蒸发采用旋蒸仪在40℃条件下蒸发至100mL；孵育过程中，碳量子点cCQD与多肽段溶液等体积孵育，多肽段溶液的浓度为40μm，孵育的条件为25℃下孵育2h。4.一种氧化碳纳米角的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将碳纳米角、N,N
‑
二甲基甲酰胺、发烟硝酸混合，搅拌，回流；降温，去除上清液后加入蒸馏水混匀，离心，反复重复上述水洗操作，直至pH＝7。5.根据权利要求4所述氧化碳纳米角的制备方法，其特征在于，混合时加入材料的顺序为碳纳米角、N,N
‑
二甲基甲酰胺、发烟硝酸；碳纳米角、N,N
‑
二甲基甲酰胺、发烟硝酸的质量体积比为4g：4mL：4mL；回流的条件为：140℃油浴锅中搅拌回流24h，之后降温至室温；离心的条件为13000rpm离心10min。6.一种用于检测蛋白激酶A的试剂，其特征在于，包括...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁潇，
申请(专利权)人：北京兴德通医药科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：