黄瓜功能着丝粒组蛋白CENH3的抗原多肽及其应用制造技术

本发明专利技术提供了黄瓜功能着丝粒组蛋白CENH3的抗原多肽及其应用，属于生物信息学及分子细胞遗传学领域。首先利用生物信息学比对筛选黄瓜CENH3蛋白的一段氨基酸序列并人工合成多肽，根据该段抗原多肽免疫新西兰兔，制备抗血清，亲和纯化后得到CENH3蛋白抗体；所得抗体通过免疫荧光检测和CHIP

【技术实现步骤摘要】
黄瓜功能着丝粒组蛋白CENH3的抗原多肽及其应用


[0001]本专利技术涉及生物信息学及分子细胞遗传学领域，具体涉及黄瓜功能着丝粒组蛋白CENH3的抗原多肽及其应用。

技术介绍

[0002]着丝粒作为高等真核生物染色体上的重要结构之一，是动粒形成和微管附着的中心，在细胞分裂过程中保证姐妹染色单体的粘附和均等分离，从而确保遗传物质稳定遗传。然而，着丝粒序列含有大量的高度重复序列，大大增加了着丝粒区域序列测定及分析的难度。近年来随着分子细胞遗传学技术、生物信息学分析方法，尤其是染色质免疫共沉淀技术(Chromatin immunoprecipitation，CHIP)与高通量测序相结合的技术(CHIP
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seq)的发展，人们对着丝粒的结构、功能和进化的研究有了巨大进展。
[0003]着丝粒蛋白与着丝粒DNA异染色质相互作用，微观上构成一个大的DNA
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蛋白质复合结构，从而确保着丝粒功能正常行使。在众多着丝粒蛋白中，着丝粒特异组蛋白CENH3是着丝粒组蛋白H3的变体，位于动粒结构域上，它的存在是活性着丝粒的标志。利用CENH3抗体可以从多种角度对着丝粒进行研究，包括：(1)通过免疫荧光技术(immunofluorescence)分辨着丝粒的位置和大小；(2)通过免疫荧光技术结合超分辨率显微观察技术研究着丝粒超微结构(Schubert，Neumann，Marques，Heckmann，&Houben，2020)；(3)应用CHIP
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seq研究着丝粒序列组成和结构。
[0004]其中CHIP
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seq技术是目前研究着丝粒序列组成的最常用方法，主要流程包括：抗体制备、CHIP富集着丝粒DNA、所富集DNA的高通量测序分析和CHIP
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DNA的荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization，FISH)验证(CHIP
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FISH)。
[0005]近几年利用该蛋白抗体的CHIP
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seq分析已进行了马铃薯(Gong et al.，2012)、莲藕(Zhu et al.，2016)等多种植物着丝粒序列研究，但葫芦科植物还未见报导，利用黄瓜CENH3抗体进行功能着丝粒的研究，对于黄瓜着丝粒区域基因组装、黄瓜遗传图谱和物理图谱的构建，及人工染色体的构建都有重要意义。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供黄瓜功能着丝粒蛋白CENH3的抗原多肽，利用该段抗原多肽设计黄瓜CENH3蛋白特异抗体，该抗体能够与黄瓜着丝粒特异组蛋白CENH3特异结合，进而可用于开展黄瓜着丝粒相关研究，如确定黄瓜染色体上功能着丝粒的位置和大小以及序列信息等，为黄瓜基因组着丝粒区域的序列组装及遗传图谱和物理图谱的构建提供信息，从而为黄瓜着丝粒的结构、功能和进化及相关研究奠定基础。
[0007]为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案如下：
[0008]黄瓜功能着丝粒抗原多肽，其氨基酸序列为TPLNGRTQNVRQAQN。
[0009]所述抗原多肽是根据黄瓜CENH3蛋白氨基酸序列N端的一段特异序列合成的一条多肽，该段抗原多肽用于制备抗体，所制抗体经检验能特异识别黄瓜着丝粒区域。
[0010]黄瓜CENH3蛋白氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示；编码所述黄瓜功能着丝粒特异组蛋白CENH3的基因，其核苷酸序列为SEQ ID N0.1所示。
[0011]上述多肽的合成方法：通过使用拟南芥HTR12(又叫AtCENH3，GenBank：AAL86775.1)作为查询对黄瓜基因组数据库进行BLAST搜索，得到了一个最为匹配的同源基因，并选取CENH3蛋白氨基酸N端的一段特异序列人工合成一条多肽。
[0012]上述抗体的制备方法：以上述合成的多肽为抗原，常规免疫新西兰大白兔，制备抗血清，最后经过抗原亲和纯化得到CENH3蛋白的抗体。
[0013]上述抗体验证方法：经过免疫荧光检测和染色质免疫共沉淀Chromatin immunoprecipitation，ChIP)所获得的DNA原位杂交实验(ChIP
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FISH)检测，结果显示该抗体特异结合黄瓜染色体着丝粒部位，证实该抗体为黄瓜功能着丝粒组蛋白CENH3的抗体。
[0014]有益效果
[0015]运用本专利技术公开的15个特异氨基酸制备抗原多肽，并用所制多肽免疫新西兰兔获得CENH3蛋白抗体，该抗体经免疫荧光检测和CHIP
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FISH进行特异性验证，，结果显示只在着丝粒的位置出现了明亮且清晰的信号，表明本专利技术所得到的CENH3蛋白的抗体真实且可靠，可以进行后续的使用。
[0016]本专利技术有利于开展黄瓜着丝粒方面的研究，可以在后续的研究中通过ChIP
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FISH和ChIP
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seq获得黄瓜功能着丝粒的位置大小以及序列信息，构建和完善黄瓜遗传图谱和物理图谱，从而进一步探讨黄瓜着丝粒形成与功能行使的机制。
附图说明
[0017]图1：黄瓜CENH3蛋白抗体的免疫荧光实验A：黄瓜有丝分裂中期染色体，B：荧光信号，C：合成图。
[0018]图2：黄瓜CENH3蛋白抗体的染色质免疫沉淀所获得的DNA荧光原位杂交实验(Chip
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FISH)A：黄瓜有丝分裂中期染色体，B：荧光信号，C：合成图。从图中可以看到，本专利技术获得的抗体产生的免疫荧光信号和FISH信号均在黄瓜染色体的着丝粒区域，验证了CENH3抗体的可用性。ChIP得到的DNA可用来进一步的测序分析。(标尺＝5μm)
具体实施方式
[0019]实施例1：黄瓜功能着丝粒组蛋白CENH3序列的获得
[0020]首先通过使用拟南芥HTR12(又叫AtCENH3，GenBank：AAL86775.1)作为查询对黄瓜基因组数据库进行BLAST搜索，得到了一个最为匹配的同源基因(GenBank：XP_011659153.1)，找到了黄瓜的CENH3蛋白的全长DNA序列，由此得到了黄瓜的CENH3蛋白的编码序列以及CENH3的蛋白序列。并分别与水稻(Oryza sativa)，拟南芥(Arabidopsis thaliana)的CENH3蛋白具有48％，61％的同源性。CENH3蛋白的N端氨基酸序列高度可变，C端HFD区域的高度保守。
[0021]实施例2：抗原的选择
[0022]根据获得的黄瓜功能着丝粒CENH3的蛋白序列，通过生物信息学软件比对CENH3蛋白序列，得到黄瓜CENH3蛋白氨基酸N端的特异序列(TPLNGRTQNVRQAQN)，采用这一段序列人工合成多肽，经过HPLC和质谱鉴定，该多肽的纯度在90％以上，抗体浓度为0.8mg/ml，将抗
体分装后，
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20℃保存。
[0023]实施例3：抗体的制备与评价
[0024]1、以上述获得的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.黄瓜功能着丝粒蛋白CENH3抗原多肽，其特征在于，氨基酸序列为TPLNGRTQNVRQAQN。2.根据权利要求1所述的黄瓜功能着丝粒抗原多肽，其特征在于：所述抗原多肽是根据黄瓜CENH3蛋白氨基酸序列N端的一段特异序列合成的一条多肽，黄瓜CENH3蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；编码所述黄瓜CENH...

【专利技术属性】
技术研发人员：娄群峰，王怡，周芳，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：