改性的肌酸酶制造技术

本发明专利技术涉及具有肌酸脒基水解酶活性的突变多肽，其中所述多肽在改性硫醇基的试剂存在下保持热稳定活性。本发明专利技术还涉及用于产生该突变多肽的方法；并且涉及包含该突变多肽的传感器用于测量生理流体样本中肌酸酐的用途。另外，本发明专利技术教导如何使用突变多肽提高肌酸酐传感器的寿命，以及制备传感器的方法。以及制备传感器的方法。以及制备传感器的方法。

【技术实现步骤摘要】
改性的肌酸酶
[0001]本申请是基于申请日为2016年2月23日，优先权日为2015年2月27日，申请号为201680011877.8，专利技术名称为：“改性的肌酸酶”的专利申请的分案申请。


[0002]本专利技术涉及具有肌酸脒基水解酶活性的突变多肽，其中所述多肽在改性硫醇基的试剂存在下保持活性并具有增强的热稳定性。本专利技术还涉及用于产生该突变多肽的方法；并且涉及包含该突变多肽的传感器用于测量生理流体样本中肌酸酐的用途。另外，本专利技术教导如何使用突变多肽提高肌酸酐传感器的寿命，以及制备传感器的方法。

技术介绍

[0003]生理流体样本诸如全血、血清、血浆或尿液中的肌酸酐水平是肾功能的一项重要指标。肌酸磷酸储存于脊椎动物的肌肉中并且提供能量储备。其不可逆地转化成肌酸酐(降解产物)和高能磷酸基团。在正常的肌功能期间，每天约1
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2％的肌酸磷酸总量转化成肌酸酐。肌酸酐释放到血液中并通过肾排出。因此，在健康个体中，肌酸酐的水平相对恒定地为约35至约75μM。如果血液中的肌酸酐的水平增大，则其可能为某些肾功能障碍的病征。在此类情况中，肌酸酐水平可增大至高达2,000μM的水平。
[0004]来源于受试者的生理流体样本中的肌酸酐水平可通过酶促方法，例如使用肌酸酐亚氨基水解酶(通过检测NH3)或肌酸酐酰胺水解酶测量。肌酸酐酰胺水解酶也被称为“肌酸酐酶”。就肌酸酐酶而言，生理流体中的肌酸酐水平可通过涉及肌酸酐酶(EC 3.5.2.10)、肌酸脒基水解酶(EC3.5.3.3——“肌酸酶”)和肌氨酸氧化酶(EC 1.5.3.1)的酶级联反应测定，如由以下反应表示：
[0005][0006][0007][0008]该反应级联导致形成H2O2，其继而可通过电流测定法或光度测量法进行检测。在一些体系中，可使用另外的酶(例如过氧化物酶)或指示剂(例如发光团)。
[0009]生理流体样本中的肌酸酐水平可使用适于测量肌酸酐的传感器测量，例如包含与肌酸酶和肌氨酸氧化酶组合的肌酸酐酶的传感器。此类传感器通常被称为生物传感器并且可采用电化学和/或光度学原理两者。
[0010]中间产物肌酸也存在于这种血液、血清、血浆或尿液样本中。因此，如果通过以上酶级联反应测定肌酸酐，则优选地采用双传感器系统。使用双传感器系统，可将肌酸酐测定为两种物质总和与单独的中间产物之间的差值。因此，在用于测定样本中肌酸酐和肌酸的总浓度的第一传感器中，肌酸酐酶、肌酸酶和肌氨酸氧化酶均存在，以将肌酸酐和肌酸转化成H2O2。在用于测定样本中肌酸的浓度的第二传感器中，存在肌酸酶和肌氨酸氧化酶，以将肌酸转化成H2O2。样本中肌酸酐的浓度因而从样本中肌酸酐和肌酸的总浓度与样本中肌酸
的浓度之间的差值来确定。
[0011]设计用于分析连续的生理流体样本的生物传感器通常采用将样本递送至传感器或从传感器递送的流动通道；其中各个样本的递送通常在分析后续样本之前继之以冲洗步骤。冲洗步骤用于防止一个样本污染下一个样本，但是也可用于防止传感器和样本流动通道中的细菌生长和生物膜形成。冲洗(或防腐剂)溶液包含活性剂2
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甲基
‑4‑
异噻唑啉
‑3‑
酮(也称为甲基异噻唑啉或MIT)或其它异噻唑啉酮衍生的生物杀灭剂，可用于控制含水溶液中的微生物生长。
[0012]防腐剂溶液中存在的异噻唑啉酮或MIT为硫醇灭活剂，其与细菌和真菌中的各种蛋白质/酶相互作用，导致细胞生长被抑制；不可逆的细胞损伤和细胞死亡。使用异噻唑啉酮或MIT试剂的缺点在于，通过使一种或多种含硫醇基的酶在生物传感器中反应和灭活，其可限制生物传感器的有效寿命。肌酸酶为含硫醇的水解酶，其活性可被硫醇灭活剂(诸如异噻唑啉酮衍生的试剂，包括MIT)抑制，这限制了这些防腐剂在用于测量生理流体样本中的肌酸酐的传感器中的使用。
[0013]因此，需要存在一种这样的肌酸酶：更耐受硫醇灭活剂；使得含此类试剂的冲洗溶液能够在用于测量肌酸酐的传感器中使用。此外，需要一种对硫醇灭活剂的耐受性增强且同时具有热稳定特性的肌酸酶。这是因为通常使用安装于分析仪中的生物传感器并将其在37℃下保存，因此重要的是生物传感器的组分在环境温度范围内(例如至少高至37℃)很稳定。
[0014]根据JPH10174585(A)，属于产碱菌(Alcaligenes)的细菌通常表现出优异的热稳定性。JPH10174585(A)还公开了使用蛋白质工程技术产生编码突变肌酸脒基水解酶的突变产碱菌基因，该突变肌酸脒基水解酶在如45℃的温度下具有改善的长期稳定性。突变酶的特征在于相比于野生型肌酸脒基水解酶，第15位的谷氨酸、以及第104位和第135位的精氨酸之中的一个、或两个或更多个组合的替换位置；其中野生型序列在AB016788中有所阐述。
[0015]据报道产碱菌菌株KS
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85基因(GenBank:BAA88830.1)编码热稳定性肌酸酶(EC 3.5.3.3)。
[0016]JPH07255485(A)描述了由黄杆菌(Flavobacterium)U
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188肌酸酶基因变异的突变获得的突变肌酸酶；由此氨基酸序列第166、第277和第328位中的至少一者被疏水性氨基酸如异亮氨酸替换。突变肌酸酶在55℃保存时保持1个小时的活性。

技术实现思路

[0017]本专利技术提供一种更耐受硫醇试剂诸如MIT或其它异噻唑啉酮衍生的试剂的突变肌酸酶。包含突变肌酸酶的传感器与防腐剂诸如Neolone 950的使用是相容的，当其与“标准”(且有效)浓度的Neolone 950结合使用时具有更长的使用寿命。
[0018]根据第一实施方案，本专利技术提供一种具有肌酸脒基水解酶活性的分离的突变多肽，该突变多肽在高于25℃的温度下在硫醇试剂诸如MIT或其它异噻唑啉酮衍生的试剂存在下保持酶活性，其中所述多肽为：
[0019]a.包含与SEQ ID No:2具有至少80％同一性的氨基酸序列的多肽；其中第175位的氨基酸残基半胱氨酸被丙氨酸替换并且第299位的氨基酸残基半胱氨酸被丙氨酸替换，或者
[0020]b.具有选自以下项的氨基酸序列的多肽：SEQ ID No 3(对应于产碱菌属(Alcaligenes sp.)肌酸脒基水解酶——Uniprot：Q9RHU9，具有替换：C175A+C299A)；SEQ ID No 7(对应于人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropic)肌酸酶——Uniprot：A0A076WGB5，具有替换：C171A+C295A)；SEQ ID No 11(对应于中慢生根瘤菌属(Mesorhizobium sp.)LNHC221B00肌酸酶——Uniprot：X6DLM3，具有替换：S175A+C299A)；SEQ ID No 15(对应于玫瑰变色菌属(Roseovarius sp)TM1035肌酸酶——Uniprot：A6DVF8，具有替换：C175A+C299A)；SEQ ID No 19(对应于玫瑰变色菌属本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种酶活性的肌酸脒基水解酶多肽突变体，其突变自天然肌酸酶(EC 3.5.3.3)，所述天然肌酸酶由编码产碱菌属肌酸酶Q9RHU09的天然基因的同源物编码，其中当所述天然肌酸酶的氨基酸序列与SEQ ID NO:2比对时，所述肌酸脒基水解酶多肽突变体在所述天然肌酸酶的对应于SEQ ID NO:2中的C175和C299的那些位置包含丙氨酸。2.根据权利要求1所述的脒基水解酶多肽突变体，其中所述天然肌酸酶与SEQ ID NO:2具有至少80％的序列同一性。3.根据权利要求1所述的脒基水解酶多肽突变体，其选自：SEQ ID NO:3；SEQ ID NO:7；SEQ ID NO:11；SEQ ID NO:15；SEQ ID NO:19；SEQ ID NO:23；SEQ ID NO:27；SEQ ID NO:31；SEQ ID NO:35；SEQ ID NO:39；SEQ ID NO:43；和SEQ ID NO:47。4.根据权利要求1或2所述的脒基水解酶多肽突变体，其在对应于SEQ ID NO:2中的C268的位置进一步具有亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸或丙氨酸。5.根据权利要求4所述的脒基水解酶多肽突变体，其选自：SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:8；SEQ ID NO:12；SEQ ID NO:16；SEQ ID NO:20；SEQ ID NO:24；SEQ ID NO:28；SEQ ID NO:32；SEQ ID NO:36；SEQ ID NO:40；SEQ ID NO:44；和SEQ ID NO:48。6.一种分离的多核苷酸，其包含编码权利要求1
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5中任一项所述的酶活性的肌酸脒基水解酶多肽突变体的核苷酸序列。7.一种包含权利要求6所述的多核苷酸的核酸构建体，所述多核苷酸可操作地连接至一个或多个指导所述酶活性的肌酸脒基水解酶多肽突变体在表达宿主中产生的控制序列。8.一种经基因修饰的宿主细胞，其包含编码权利要求1
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5中任一项所述的酶活性的肌酸脒基水解酶多肽突变体的核酸构建体，其中所述细胞优选地选自细菌细胞、酵母细胞和真菌细胞。9.一种用于产生权利要求1
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5中任一项所述的酶活性的肌酸脒基水解酶多肽突变体的方法，所述方法包括以下步骤：a.提供重组宿主细胞，其中所述细胞包含DNA分子，所述DNA分子包含编码根据权利要求1
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5中任一项所述的酶活性的肌酸脒基水解酶多肽突变体的核酸序列，b.在适于表达所述酶活性的肌酸脒基水解酶多肽突变体的条件下孵育所述宿主细胞，以及c.回收步骤b)中所述宿主细胞表达的酶活性的肌酸脒基水解酶多肽突变体。10.一种包含根据权利要求1
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【专利技术属性】
技术研发人员：P施奈德，J奥斯特加德，TS汉森，
申请(专利权)人：雷迪奥米特医学公司，
类型：发明
国别省市：