一种酶法合成布瓦西坦手性中间体的方法技术

本发明专利技术公开了一种酶法合成布瓦西坦手性中间体的方法，即利用具有腈水解活性的酶催化3

【技术实现步骤摘要】
一种酶法合成布瓦西坦手性中间体的方法
(一)

[0001]本专利技术涉及一种酶法合成布瓦西坦手性中间体的方法，特别涉及利用具有腈水解活性的酶合成布瓦西坦手性中间体的方法。
(二)
技术介绍

[0002]布瓦西坦，化学名为(2S)
‑2‑
[(4R)
‑2‑
氧代
‑4‑
丙基
‑1‑
吡咯烷基]丁酰胺，是比利时优时比制药公司(UCB)研发的新一代抗癫痫药物，其化学结构如式(I)所示。
[0003][0004]布瓦西坦在临床上用于治疗全身性癫痫，是突触囊泡蛋白2A(SV2A)的高亲合体配体，同时对钠离子通道具有一定的抑制性。2016年2月，美国食品药品管理局(FDA)批准布瓦西坦上市，成为治疗癫痫的新一代药物，市场前景广阔。化合物(II)和化合物(III)是众多布瓦西坦合成路线的关键手性中间体，它们可由(R)
‑3‑
氨甲基己酸(IV)关环合成。因此，构建一种绿色高效、本质安全和高原子经济性的(R)
‑3‑
氨甲基己酸(IV)制备方法对布瓦西坦工业化生产具有重要意义。
[0005][0006]目前，化合物(IV)的合成路线主要有以下两条：
[0007]路线一：以手性苯乙胺拆分化合物(VIII)，得到化合物(VII)，再在次氯酸钠或者次溴酸钠作用下，经霍夫曼降解得到化合物(IV)(CN113045468A)。该方法手性拆分步骤复杂，拆分收率较低，同时产生少量的异构化杂质，不利于工业化生产。
[0008][0009]路线二：以化合物(X)为起始原料，分别与二异丁胺和溴代乙酸酯反应合成化合物(IX)，再经转氨酶催化还原胺化制备手性化合物(IV)(WO2016075082)。该方法合成工艺复杂，产物ee值仅为90％左右，难以满足工业化生产需求。
[0010][0011]生物催化有机腈水解具有选择性严格、反应条件温和以及可持续发展等显著优势，已成为制备手性羧酸的重要方法。本专利技术通过腈水解酶区域、立体选择性水解3
‑
氰基己腈高效合成(R)
‑3‑
氰基己酸(V)，再加氢还原合成(R)
‑3‑
氨甲基己酸(IV)，进而制备布瓦西坦中间体化合物(II)和化合物(III)。
(三)
技术实现思路

[0012]本专利技术目的是提供一种酶法合成布瓦西坦手性中间体的方法，特别是利用具有腈水解活性的酶催化3
‑
氰基己腈水解合成(R)
‑3‑
氰基己酸的方法，再通过(R)
‑3‑
氰基己酸加氢还原合成(R)
‑3‑
氨甲基己酸，构建一种全新的布瓦西坦酶法合成工艺，对于实现布瓦西坦的工业化绿色合成具有重要意义。
[0013]本专利技术采用的技术方案是：
[0014]第一方面，本专利技术提供一种酶法合成布瓦西坦手性中间体的方法，所述方法为利用具有腈水解活性的酶催化3
‑
氰基己腈(VI)水解合成(R)
‑3‑
氰基己酸，具体为：以含具有腈水解活性的酶编码基因的重组基因工程菌经诱导表达后获得的湿菌体为催化剂，以3
‑
氰基己腈(IV)为底物，以pH 7
‑
8的缓冲液或水为介质构成反应体系，在20
‑
40℃、200
‑
600rpm(优选30℃、300rpm)条件下反应完全后，反应液分离纯化获得(R)
‑3‑
氰基己酸(V)；所述具有腈水解活性的酶为腈水解酶，所述腈水解酶是将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列第140位或第175位氨基酸进行单突变或双突变获得的。
[0015]优选，所述腈水解酶是将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列进行下列之一的突变：(1)第140位色氨酸突变为甘氨酸(W140，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示、氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示)；(2)第140位色氨酸突变为甘氨酸、同时第175位蛋氨酸突变为苏氨酸(W140G/M175T，核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示、氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示)。
[0016]优选，所述反应体系中，催化剂的用量以菌体干重计为1
‑
10g/L(优选3g/L)，底物浓度为100
‑
300g/L(优选150g/L)。
[0017]优选，所述催化剂按如下方法制备：将含具有腈水解活性的酶编码基因的重组基因工程菌接种至含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养过夜，再以2％(v/v)接种量接种到含50μg/mL卡那霉素LB培养基中，37℃，150rpm培养至菌体浓度OD
600
＝0.6，加入终浓度为0.1mM的IPTG，28℃诱导培养12h后，4℃、12000rpm离心10min，收集湿菌体。
[0018]优选，催化剂为所述湿菌体经破碎提取的粗酶、粗酶纯化后的纯酶、固定化湿菌体细胞或者固定化酶；即所述催化剂可以是表达腈水解酶的重组基因工程菌全细胞，也可以是未经纯化的粗酶形式使用，也可以是部分纯化的或完全纯化的酶的形式使用。还可以利用本领域已知的固定化技术将本专利技术的腈水解酶突变体制成固定化酶或固定化细胞形式的生物催化剂。
[0019]优选，所述3
‑
氰基己腈按如下方法制备：将正丁醛、哌啶、氰基乙酸乙酯和正己烷的混合物在30
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40℃反应10
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15h后(优选35℃，12h)，将得到的反应物减压蒸馏除去溶剂得到油状物；在油状物中加入异丙醇和含氰化钾的水溶液，维持30
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40℃反应3
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8h(优选35℃反应5h)后，在80
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110℃温度下回流3
‑
8h(优选95℃反应5h)；将反应物冷却至室温后，用水稀释，并用甲基叔丁酯萃取，将萃取液用水洗涤三次后，用无水硫酸镁干燥，并在真空条件下浓缩至无液体流出，得到油状产物3
‑
氰基己腈(VI)；所述哌啶与正丁醛、氰基乙酸乙酯和氰化钾的质量比为1：80
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90：100
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150：60
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100(优选1:85
‑
86:122
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123:70)；所述正己烷体积用量以正丁醛、哌啶和氰基乙酸乙酯总量计为1
‑
5mL/g(优选2
‑
3mL/g)；所述异丙醇与正己烷体积比为5:3；所述含氰化钾的水溶液与正己烷体积比为5:3；所述稀释用的水与正己烷体积比为2:3；所述甲基叔丁酯与正己烷体积比为5:3。
[0020]所述(R)
‑3‑
氰基己酸(V)制备(R)
‑3‑
氨甲基己酸(IV)的方法为：取(R)
‑3‑
氰基己酸于加氢反应釜中，加入催化剂Raney镍，通入氮气置换空气3次，再通入氢气至最本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种酶法合成布瓦西坦手性中间体的方法，其特征在于，所述方法为利用具有腈水解活性的酶催化3
‑
氰基己腈水解合成布瓦西坦手性中间体(R)
‑3‑
氰基己酸的方法。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的方法为：以含具有腈水解活性的酶编码基因的重组基因工程菌经诱导表达后获得的湿菌体为催化剂，以3
‑
氰基己腈为底物，以pH7
‑
8的缓冲液或水为介质构成反应体系，在20
‑
40℃、200
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600rpm条件下反应完全后，反应液分离纯化获得(R)
‑3‑
氰基己酸。3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述的具有腈水解活性的酶为腈水解酶。4.如权利要求3所述的方法，所述腈水解酶是将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列第140位或第175位氨基酸进行单突变或双突变获得的。5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述腈水解酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.6所示。6.如权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑仁朝，郑裕国，詹侃，吴哲明，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：