酶活提高的精氨酸脱亚胺酶突变体制造技术

本发明专利技术公开了酶活提高的精氨酸脱亚胺酶突变体，属于基因工程和酶工程技术领域。本发明专利技术利用定点突变技术对野生型精氨酸脱亚胺酶arcA编码基因进行分子改造，得到了一系列突变体酶ADI

【技术实现步骤摘要】
酶活提高的精氨酸脱亚胺酶突变体


[0001]本专利技术涉及酶活提高的精氨酸脱亚胺酶突变体，属于基因工程和酶工程


技术介绍

[0002]精氨酸脱亚胺酶(Arginine deiminase，EC 3.5.3.6)简称ADI，它能将精氨酸水解，生成瓜氨酸和氨，因此可用于瓜氨酸的生产。精氨酸脱亚胺酶的微生物来源十分广泛，从1933年被首次发现以来，已在乳链球菌、粪链球菌、酵母、假单胞菌、支原体、盐杆菌及部分真核细胞等中发现有该酶存在。不同微生物来源的ADI分子量范围，最适pH、最适温度等酶学性质具有明显的差异。
[0003]目前，ADI主要被研究用于瓜氨酸的生产，具有反应条件温和、转化效率高、提取工艺简单等优点，具有较高的研究和生产价值。然而，目前已被报道发现的大部分ADI都表现出低比酶活力，这成为ADI产业应用的技术瓶颈。因此，寻找催化效率更高、安全稳定的精氨酸脱亚胺酶成为该酶用于功能性食品配料生物制造的关键问题。

技术实现思路

[0004]本专利技术提供了经定点突变改造的精氨酸脱亚胺酶突变体，以奥氏嗜热盐丝菌(Halothermothrix orenii)的精氨酸脱亚胺酶基因登录号：NC_011899.1:720621
‑
721853，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，运用定点突变技术获得。
[0005]在一种实施方式中，所述突变体是将出发酶的第116位天冬氨酸，第203位苏氨酸，第103位丙氨酸，第32位苏氨酸或第345位甘氨酸进行了突变。
[0006]在一种实施方式中，所述突变体是将出发酶的第116位天冬氨酸突变为甘氨酸，获得突变体N116G，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0007]在一种实施方式中，所述突变体是将出发酶的第203位苏氨酸突变为甘氨酸，获得突变体T203G，氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0008]在一种实施方式中，所述突变体是将出发酶的第103位丙氨酸突变为酪氨酸，获得突变体A103Y，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
[0009]在一种实施方式中，所述突变体是将出发酶的第32位苏氨酸突变为酪氨酸，获得突变体T32Y，氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
[0010]在一种实施方式中，所述突变体是将出发酶的第345位甘氨酸突变为丙氨酸，获得突变体G345A，氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
[0011]本专利技术还提供了编码所述突变体的基因。
[0012]在一种实施方式中，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.7～11所示。
[0013]本专利技术还提供了携带所述基因的重组质粒。
[0014]在一种实施方式中，所述重组质粒包括但不限于pET系列质粒。
[0015]本专利技术还提供了表达所述突变体的重组微生物细胞。
[0016]在一种实施方式中，所述重组微生物细胞包括但不限于细菌或真菌。
[0017]在一种实施方式中，所述微生物为大肠杆菌。
[0018]在一种实施方式中，所述大肠杆菌以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主，以pET
‑
28a为载体，表达所述精氨酸脱亚胺酶突变体。
[0019]本专利技术还提供一种提高精氨酸脱亚胺酶酶活的方法，所述方法是将奥氏嗜热盐丝菌(Halothermothrix orenii)来源的精氨酸脱亚胺酶的第116位天冬氨酸，第203位苏氨酸，第103位丙氨酸，第32位苏氨酸或第345位甘氨酸进行突变。
[0020]在一种实施方式中，所述方法是将奥氏嗜热盐丝菌来源的精氨酸脱亚胺酶的第116位天冬氨酸突变为甘氨酸，或将第203位苏氨酸突变为甘氨酸，或将第103位丙氨酸突变为酪氨酸，或将第32位苏氨酸突变为酪氨酸，或将第345位甘氨酸突变为丙氨酸。
[0021]本专利技术还提供一种生产精氨酸脱亚胺酶突变体的方法，是将表达所述突变体的重组大肠杆菌在LB培养基中，于30～37℃培养至少12h。
[0022]在一种实施方式中，所述方法还对重组大肠杆菌进行诱导；所述诱导是将所述重组大肠杆菌培养至OD
600
在0.5～0.7范围内，加入0.5mmol/L的IPTG在28℃、200r/min条件下诱导6h。
[0023]本专利技术还提供所述精氨酸脱亚胺酶突变体在氨基酸生产或抗肿瘤药物的制备方面的应用。
[0024]有益效果：本专利技术提供的一系列精氨酸脱亚胺酶突变体酶活相比于野生酶均有了明显的提高，突变后的酶仍保持着适中的pH，且酶活可达135.8U/mg,154.9U/mg,158.7U/mg,163.0U/mg,194.1U/mg，相比于野生型酶活提高了1.47
‑
2.11倍。本专利技术优化改良了野生型的精氨酸脱亚胺酶酶活较低的问题，为该酶在实际应用中创造更好的使用条件。
附图说明
[0025]图1为重组质粒的构建图谱。
[0026]图2为野生酶WT和突变酶的相对酶活。
具体实施方式
[0027]材料与试剂：所用的限制性内切酶、SolutionⅠ连接酶、PCR试剂等均购于TaKaRa宝生物公司；质粒提取试剂盒、基因组提取试剂盒、琼脂糖纯化试剂盒、E.coil DH5α、E.coil BL21(DE3)菌株、引物均购于生工生物工程(上海)有限公司；其他试剂均为国内或国外购买的分析纯试剂。
[0028]实施例1：精氨酸脱亚胺酶突变位点的设计
[0029]多序列比对结合在线服务器HotSpot Vizard(https://loschmidt.chemi.mu ni.cz/hotspotwizard/)选择突变位点；利用SWISS
‑
MODEL软件对精氨酸脱亚胺酶蛋白结构进行模拟，获得精氨酸脱亚胺酶的三级结构模型。确定要突变的氨基酸位点为第116位天冬氨酸，第203位苏氨酸，第103位丙氨酸，第32位苏氨酸，第345位甘氨酸，第340位天冬氨酸，第398位脯氨酸。
[0030]实施例2：精氨酸脱亚胺酶的定点突变及重组质粒、重组大肠杆菌的构建
[0031]根据SEQ ID NO.1所示的Halothermothrix orenii来源的编码arcA的基因进行引
物设计：
[0032]N116G
‑
F:ATATGGACGGCGAGACACTTATTCGTAAGATGATGGC；
[0033]N116G
‑
R:TGTCTCGCCGTCCATATCTGCGAAGTACTCCTTT；
[0034]T203G
‑
F:CAAGGATGGCGAAATCCCCTTCTGGTTTGATCG；
[0035]T203G
‑
R:GGATTTCGCCATCCTTGAAGTCCGGATGGTACG；
[0036]A103Y
‑
F:TAAGGGGTATCG本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.精氨酸脱亚胺酶突变体，其特征在于，在奥氏嗜热盐丝菌(Halothermothrix orenii)来源的精氨酸脱亚胺酶的基础上，进行了如下至少一种突变：(1)将第116位天冬氨酸突变为甘氨酸；(2)将第203位苏氨酸突变为甘氨酸；(3)将第103位丙氨酸突变为酪氨酸；(4)将第32位苏氨酸突变为酪氨酸；(5)将第345位甘氨酸突变为丙氨酸。2.编码权利要求1所述突变体的基因。3.携带权利要求2所述基因的重组质粒。4.表达权利要求1所述突变体的重组微生物细胞。5.根据权利要求4所述的重组微生物细胞，其特征在于，宿主细胞为细菌或真菌。6.一种重组大肠杆菌，其特征在于，以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主，以pET
‑
28a为载体，表达权利要求1所述的精氨酸脱亚胺酶突变体。7.一种提高精...

【专利技术属性】
技术研发人员：张涛，王文玉，江波，高巍，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：