一种人间充质干细胞培养基制造技术

本发明专利技术公开了一种人间充质干细胞培养基，包括胎牛血清、胰岛素、转铁蛋白、成纤维生长因子

【技术实现步骤摘要】
一种人间充质干细胞培养基


[0001]本专利技术涉及一种人间充质干细胞培养基，属于生物材料领域。

技术介绍

[0002]间充质干细胞(MSC,mesenchymal stem cells)是一种多能干细胞，具有一定的分化潜能，可以分化为骨骼肌、心肌、脂肪、软骨、骨骼等多种细胞类型。应用于临床，可用于目标细胞群的替换和损伤病变组织器官的修复。具有免疫调节功能，可以发挥免疫重建的功能。异体移植排异反应较轻，对配型的要求不严格，因而应用广泛。
[0003]间充质干细胞主要存在于骨髓中，也能够从脂肪、滑膜、骨骼、肌肉、肺、肝、胰腺等组织以及羊水、脐带血中分离和制备间充质干细胞。
[0004]分离人间充质干细胞后，需要培养人间充质干细胞到足够量，用于分化为目标组织。也需要在培养过程中保持分化潜能。我们发现用传统细胞培养基，以(DMEM+10％FBS)为例，培养人间充质干细胞，细胞到第三代就会出现明显的衰老特征，因此，亟需一种能较多代数培养人间充质干细胞，并且保持其分化潜能的培养基。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是克服现有技术的不足，提供一种人间充质干细胞培养基。
[0006]本专利技术的技术方案概述如下：
[0007]一种人间充质干细胞培养基，包括胎牛血清：25ml、胰岛素：5mg、转铁蛋白：2.75mg、成纤维生长因子
‑
2：5ug、胰岛素样生长因子2：5ug、牛磺酸：0.625mg、盐酸腐胺：0.5mg、甲基b
‑
D
‑
木吡喃糖苷：50mg、α
‑
酮戊二酸：7.3mg、牛血清白蛋白：0.625g、亚油酸：2.675mg、胆固醇：2.5mg、α
‑
生育酚：终浓度为9
×
10
‑7M、N
‑
乙酰半胱氨酸：5mg、抗坏血酸：25mg、亚硒酸钠：3.35ug、甘氨酸：3.75mg、L
‑
丙氨酸：4.45mg、L
‑
天门冬酰胺：6.6mg、L
‑
天门冬氨酸：6.65mg、L
‑
谷氨酸：7.35mg、L
‑
丝氨酸：5.25mg、L
‑
脯氨酸：5.75mg、丙酮酸钠：27.5mg，用DMEM/F12补齐到500ml。
[0008]本专利技术的优点：
[0009]本专利技术细胞培养基培养人间充质干细胞，可以传代培养30代以上，到第30代所述干细胞仍然能保持比较好的形态，具有增殖能力，并能继续维持人间充质干细胞的分化属性，即具备向脂肪、软骨和骨的分化潜能。
附图说明
[0010]图1为培养的人间充质干细胞形态；
[0011]图2为人间充质干细胞增殖曲线；
[0012]图3为人间充质干细胞分化能力。
具体实施方式
[0013]DMEM/F12：杜尔贝科改良Eagle培养基/营养混合物F
‑
12(生产厂家：赛默飞)；其它原料均为市售。
[0014]下面通过具体实施例对本专利技术作进一步的说明。
[0015]实施例1、一种人间充质干细胞培养基，包括胎牛血清：25ml、胰岛素：5mg、转铁蛋白：2.75mg、成纤维生长因子
‑
2：5ug、胰岛素样生长因子2：5ug、牛磺酸：0.625mg、盐酸腐胺：0.5mg、甲基b
‑
D
‑
木吡喃糖苷：50mg、α
‑
酮戊二酸：7.3mg、牛血清白蛋白：0.625g、亚油酸：2.675mg、胆固醇：2.5mg、α
‑
生育酚：终浓度为9
×
10
‑7M、N
‑
乙酰半胱氨酸：5mg、抗坏血酸：25mg、亚硒酸钠：3.35ug、甘氨酸：3.75mg、L
‑
丙氨酸：4.45mg、L
‑
天门冬酰胺：6.6mg、L
‑
天门冬氨酸：6.65mg、L
‑
谷氨酸：7.35mg、L
‑
丝氨酸：5.25mg、L
‑
脯氨酸：5.75mg、丙酮酸钠：27.5mg，用DMEM/F12补齐到500ml。
[0016]实施例2
[0017]人间充质干细胞的培养：
[0018](1)P0代细胞的获得：
[0019]人脐带组织贴壁法分离人间充质干细胞。用生理盐水充分洗涤脐带，并剪成小段。将脐带纵向剪开,用镊子剥去脐带中的两根脐动脉和一根脐静脉。将脐带剪碎，均匀接种于装有15mL实施例1一种人间充质干细胞培养基的T75培养瓶中，37℃，5％二氧化碳培养，得到的细胞即为P0代细胞。
[0020](2)换液
[0021]根据步骤(1)的最终的培养基颜色(由原来的红色变成淡黄色)决定更换新的一种人间充质干细胞培养基，更换方法是用巴氏吸管吸掉旧培养基，用移液管，缓慢加入37℃预热的等量新的一种人间充质干细胞培养基。
[0022](3)传代
[0023]待细胞密度在85％以上时，分瓶培养即为传代。传代1次即为P1代细胞，以此类推。具体操作方法为：
[0024]a吸掉旧培养基，用37℃预热的pH＝7.4的PBS洗2遍细胞；
[0025]b每瓶加TrypLE
TM Express胰酶(生产厂家：赛默飞)3ml，室温消化细胞1分钟左右，待细胞变圆后，每瓶加实施例1制备的人间充质干细胞培养基10ml；
[0026]c吸出细胞悬液至50ml离心管中，1000rpm，离心3min，弃上清；
[0027]d用10ml一种人间充质干细胞培养基重悬沉淀，经细胞筛过滤，5ml人间充质干细胞培养基冲洗筛网，计数；
[0028]e调整细胞浓度，根据实际需要铺板或瓶，置于37℃、5％二氧化碳培养箱中培养。
[0029]见图1、2和3。
[0030]图1为培养的人间充质干细胞形态，其中：
[0031]A.DMEM+10％FBS培养人间充质干细胞第3代细胞形态，第3代开始，可以观察到细胞体积增大，出现明显的细胞衰老特征；
[0032]B.人间充质干细胞培养基培养人间充质干细胞第1代细胞形态；
[0033]C.人间充质干细胞培养基培养人间充质干细胞第3代细胞形态；
[0034]D.人间充质干细胞培养基培养人间充质干细胞第30代细胞形态；细胞在第30代依
然维持良好的梭形形态，没有明显的细胞衰老特征。
[0035]图2为人间充质干细胞增殖曲线。
[0036]其中，菱形点表示人间充质干细胞培养基(系列1)培养细胞的增殖曲线，圆形点表示DMEM+10％FBS(系列2)。如图2中所示，人间充质干细胞培养基培养的人间充质干细胞到第30代仍然增殖很好，DMEM+10％FBS培养的人间充质干细胞到第7代已经丢失增殖力。
[0037]图3为人本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种人间充质干细胞培养基，其特征是包括胎牛血清：25ml、胰岛素：5mg、转铁蛋白：2.75mg、成纤维生长因子
‑
2：5ug、胰岛素样生长因子2：5ug、牛磺酸：0.625mg、盐酸腐胺：0.5mg、甲基b
‑
D
‑
木吡喃糖苷：50mg、α
‑
酮戊二酸：7.3mg、牛血清白蛋白：0.625g、亚油酸：2.675mg、胆固醇：2.5mg、α
‑
生育酚：终浓度为9
×
10

【专利技术属性】
技术研发人员：黄鹏羽，何润邦，刘立会，
申请(专利权)人：中国医学科学院生物医学工程研究所，
类型：发明
国别省市：