一种提高感受态细胞转化率的方法技术

本发明专利技术公开了一种提高感受态细胞转化率的方法，在感受态细胞的制备或存放的过程中加入糖脂类生物表面活性剂，从而显著提高感受态细胞的转化率。细胞的转化率。

【技术实现步骤摘要】
一种提高感受态细胞转化率的方法


[0001]本专利技术涉及生命科学基因操作工具领域，特别是涉及一种提高感受态细胞转化率的方法。

技术介绍

[0002]转化(Transformation)是将外源DNA分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。转化效率的高低决定后续分子操作工作的开展效率与成功率，而细菌的状态是影响转化效率最关键的因素之一。已发现在许多细菌中均能发生转化现象。转化成功率与某些因子密切相关，例如受体菌处于感受态阶段可产生感受态因子，是接受外来DNA片段的最佳时期，而钙离子、环腺苷酸(cAMP)等物质亦可大大提高转化率。
[0003]然而，目前对于提高细菌转化效率的研究还有待进一步提升。从20世纪70年代开始，一直持续到今天，公开
已经报道了许多在细菌转化的基本技术方面的创新，这些技术创新的主要目的是为了提高质粒转化不同菌株的效率，包括：在不同的缓冲液中使用二价阳离子的复杂混合液，用还原剂处理细胞，调整混合液的成分以适应不同遗传背景的特殊菌株，在生长周期的特定阶段收获细胞，在加入化学试剂之前改变培养温度，优化热激的程度和温度，冷冻和融化细胞，在用二价阳离子溶液洗涤后在细胞中加入有机溶剂。

技术实现思路

[0004]基于上述情况，我们公开了一种提高感受态细胞转化率的方法，解决上述技术问题。
[0005]本专利技术提供了一种提高感受态细胞转化率的方法。
[0006]为了解决上述技术问题，本专利技术提供如下技术方案：
[0007]一种提高感受态细胞转化率的方法，在感受态细胞的制备或存放的过程中加入糖脂类生物表面活性剂。
[0008]优选的，所述的糖脂类生物表面活性剂包括槐糖脂或鼠李糖脂。
[0009]优选的，所述槐糖脂的浓度为：0.5～1g/L，所述鼠李糖脂的浓度为：1～2g/L。
[0010]优选的，所述感受态细胞的制备过程包括如下步骤：
[0011]步骤1.1：将大肠杆菌在LB琼脂平板上划线，37℃培养16～20h；
[0012]步骤1.2：在划线平板上挑一个单菌落于盛有20mL LB培养基的250mL三角瓶中；
[0013]37℃振荡培养到细胞的OD600值为0.3～0.5之间；
[0014]步骤1.3：将培养物于冰溶中放置10min，然后转移到10mL预冷的无菌离心管中，4000r/min，0℃～4℃离心10min；
[0015]步骤1.4：弃上清，倒置离心管1min，流尽剩余液体后，置于冰浴10min；
[0016]步骤1.5向离心管加入5mL用冰预冷的0.1mol/L CaCl2溶液悬浮细胞，置冰浴中20min；
[0017]步骤1.6：4000r/min，0℃～4℃离心10min回收菌体，弃上清，向离心管加入1mL冰冷的0.1mol/L CaCl2溶液，重新悬浮细胞；
[0018]步骤1.7：按每份200μL分装细胞于无菌小塑料离心管中，加入浓度为50％的无菌甘油200μL，混合作为感受态细胞置
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20℃存放备用。
[0019]优选的，在所述步骤1.2的LB培养基中添加浓度为0.5～1g/L槐糖脂或浓度为1～2g/L鼠李糖脂。
[0020]优选的，在所述步骤1.5的CaCl2溶液中添加浓度为1g/L鼠李糖脂。
[0021]优选的，在所述步骤1.7的无菌甘油中添加浓度为1g/L槐糖脂或浓度为1g/L鼠李糖脂。
[0022]优选的，在所述步骤1.2的LB培养基中添加浓度为1g/L槐糖脂，并且在所述步骤1.7的无菌甘油中添加浓度为1g/L槐糖脂。
[0023]优选的，在所述步骤1.2的LB培养基中添加浓度为1g/L鼠李糖脂，并且在所述步骤1.7的无菌甘油中添加浓度为1g/L鼠李糖脂。
[0024]细胞膜的通透性以及其对DNA的吸收能力对转化率存在较大的影响，此外感受细胞的胞外多糖及细胞壁膜，均会对外源DNA的吸收形成阻碍作用。
[0025]槐糖脂(Sophorolipid，简写SL)是由假丝酵母菌以糖和植物油等为碳源，经一定条件的发酵工艺产生的微生物次级代谢产物。槐糖脂是一种糖脂类生物表面活性剂。其具有常规表面活性剂所具有的增溶、乳化、润湿、发泡、分散、降低表面张力等通用性能，而且还具有无毒、100％可生物降解、耐温、耐高盐、适应PH范围广及对环境友好等特性。
[0026]鼠李糖脂是由假单胞菌或伯克氏菌类产生的一种生物代谢性质的生物表面活性剂。同时也是一种研究时间最长、应用技术最为成熟的一种生物表面活性剂。它在土壤、水体和植物中都自然存在。它属于一种糖脂类的阴离子表面活性剂。
[0027]无论是槐糖脂和还是鼠李糖脂被发现具有良好的抗菌性及抗生物膜的特性，其可能原因是由于鼠李糖脂可能对结构和成分有影响导致细胞膜通透性增加甚至膜破裂，甚至槐糖脂和鼠李糖酯可以抑制细胞外脂多糖(LPS)的形成(DOI:10.1016/j.micres.2017.04.005)。本专利技术把槐糖脂与鼠李糖脂用作促进外源DNA进入宿主细胞的促进剂。
[0028]与现有技术相比，本专利技术所达到的有益效果是：
[0029]在菌株的预培养阶段及感受态细胞的冻存阶段加入槐糖脂或鼠李糖脂可以显著的提高菌的转化率。其优点是能快速制备，转化效率更高，更加稳定，广泛适用于生命科学领域，提高科研人员基因操作与重组子构建效率。
具体实施方式
[0030]下面将结合本专利技术实施例，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0031]实施例1现有大肠杆菌的转化
[0032]参照参照《分子克隆实验指南》，按照经典分子生物教学的转化方案进行大肠杆菌
的转化，其过程如下：
[0033]1.制备感受态细胞
[0034]1.1将大肠杆菌HB101(上海泽叶生物科技有限公司)在LB琼脂平板上划线，37℃培养16～20h；
[0035]1.2在划线平板上挑一个单菌落于盛有20mL LB培养基的250mL三角瓶中，37℃振荡培养到细胞的OD600值为0.3～0.5之间，使细胞处于对数生长期或对数生长前期；
[0036]1.3将培养物于冰溶中放置10min，然后转移到2个10mL预冷的无菌离心管中，4000r/min，0℃～4℃离心10min；
[0037]1.4弃上清，倒置离心管1min，流尽剩余液体后，置于冰浴10min；
[0038]1.5分别向二管加入5mL用冰预冷的0.1mol/LCaCl2溶液悬浮细胞，置冰浴中20min；
[0039]1.6 4000r/min，0℃～4℃离心10min回收菌体，弃上清，分别向二管各加入1本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种提高感受态细胞转化率的方法，其特征在于，在感受态细胞的制备或存放的过程中加入糖脂类生物表面活性剂。2.根据权利要求1所述的一种提高感受态细胞转化率的方法，其特征在于，所述的糖脂类生物表面活性剂包括槐糖脂或鼠李糖脂。3.根据权利要求2所述的一种提高感受态细胞转化率的方法，其特征在于，所述槐糖脂的浓度为：0.5～1g/L，所述鼠李糖脂的浓度为：1～2g/L。4.根据权利要求3所述的一种提高感受态细胞转化率的方法，其特征在于，所述感受态细胞的制备过程包括如下步骤：步骤1.1：将大肠杆菌在LB琼脂平板上划线，37℃培养16～20h；步骤1.2：在划线平板上挑一个单菌落于盛有20mL LB培养基的250mL三角瓶中；37℃振荡培养到细胞的OD600值为0.3～0.5之间；步骤1.3：将培养物于冰溶中放置10min，然后转移到10mL预冷的无菌离心管中，4000r/min，0℃～4℃离心10min；步骤1.4：弃上清，倒置离心管1min，流尽剩余液体后，置于冰浴10min；步骤1.5向离心管加入5mL用冰预冷的0.1mol/L CaCl2溶液悬浮细胞，置冰浴中20min；步骤1.6：4000r/min，0℃～4℃离心10min回收菌体，弃上清...

【专利技术属性】
技术研发人员：张鹏，石化兵，黄瑞，余标，唐春雨，李庆廷，
申请(专利权)人：上海龙殷生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：