三唑醇含量检测用半抗原及其应用制造技术

本申请公开了一种三唑醇含量检测用半抗原及其应用，三唑醇含量检测用半抗原的化学式为：C

【技术实现步骤摘要】
三唑醇含量检测用半抗原及其应用


[0001]本申请涉及农药残留检测
，特别是一种三唑醇含量检测用半 抗原及其应用。

技术介绍

[0002]三唑醇是一种高效、广谱的唑类杀菌剂，具有针对各类微生物病害的 预防、治疗和铲除作用，可抑制麦角甾醇的生物合成。主要用于麦类、果 树、蔬菜、瓜类、花卉等作物。对小麦叶枯病、麦类云纹病、凤梨黑腐病、 玉米黑穗病等均有很好的效果。GB 2763
‑
2021《食品安全国家标准食品 中农药最大残留限量》对不同食品中三唑醇的最大残留限量为0.01～10 mg/kg。
[0003]检测三唑醇的方法有气相色谱法、气相色谱法
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质谱法、超高效液相色 谱
‑
质谱/质谱法、液相色谱
‑
质谱/质谱法等，与上述方法相比，免疫化学检 测法对药物检测具有快速、特异、灵敏、准确、可以批量监测、样品处理 简单、能实现自动化操作等优点。
[0004]而免疫化学法检测三唑醇的前提是需要具备针对三唑醇的抗体。而现 有技术中CN201510973025.4检测三唑醇的酶联免疫试剂盒及其应用，公 开了一种采用酶联免疫试剂盒的三唑醇检测抗原。但该结构抗原用于检测 烟草中残留三唑醇时，回收率偏低，当样本中三唑醇添加量为2000μg/kg 时，回收率低于80％仅为76.8％，最优的检测结果中回收率也仅为102.5％。 且该抗原的特异性较差，检测结果易受与三唑醇搭配施用的多菌灵、甲霜 灵、异菌脲等农药影响，导致对三唑醇的交叉准确检出率低。<br/>[0005]CN201510973025.4中公开的半抗原结构导致所得三唑醇酶联免疫试 剂盒对于烟叶样本的检测限仅为1000μg/kg，当样本中三唑醇的含量超过 该值后，无法进行正常检测，会导致检测误差的出现。同时现有三唑醇半 抗原用于三唑醇含量偏高的烤烟样本时，检测结果回收率偏低，准确度降 低，说明现有半抗原受样本中三唑醇含量对检测结果的影响较大。
[0006]由于经过烘烤后，烤烟内部结构改变，含水量降低，采用该现有抗原 难以准确检测烤烟中三唑醇含量。

技术实现思路

[0007]本申请提供了一种三唑醇含量检测用半抗原及其应用，用于解决现有 技术中存在的免疫化学法检测三唑醇所用抗原准确率低、检测结果无法避 免与三唑醇搭配施用的多菌灵、甲霜灵、异菌脲对检测结果的干扰的技术 问题。
[0008]本申请提供了一种三唑醇含量检测用半抗原，化学式为： C
18
H
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ClN3O6；分子式为：
[0009][0010]所述三唑醇含量检测用半抗原的制备方法，包括以下步骤：
[0011]1)将叔丁基羟基三唑醇溶解后与(S)
‑2‑
噁丙环乙酸乙酯、三乙胺、NaH 搅拌混合，在油浴条件下加热至100℃进行亲核加成反应6小时后，停止 反应；
[0012]2)所得反应物经过萃取，合并所得有机相，旋蒸蒸干得到黄色油状物；
[0013]3)添加乙醇溶解所得油状物后，加入KOH后室温条件搅拌进行水解 反应3小时停止反应，经过提纯处理后得到半抗原。
[0014]优选地，所述步骤3)中所述提纯处理包括：对所得反应物依序进行 旋蒸、除乙醇、萃取，将所得有机相蒸干后上硅胶柱，采用乙酸乙酯/石油 醚进行洗脱分离，得到所述半抗原。
[0015]优选地，所述叔丁基羟基三唑醇、(S)
‑2‑
噁丙环乙酸乙酯、三乙胺、NaH 按摩尔比为1：3：5：2混合；
[0016]优选地，叔丁基羟基三唑醇溶液浓度为0.1037g/ml。
[0017]优选地，所述萃取步骤中所用萃取剂为水、乙酸乙酯，水：乙酸乙酯 按体积比为1：0.5～0.8添加；萃取操作重复进行三次；
[0018]优选地，步骤3)中KOH的添加量为叔丁基羟基三唑醇摩尔数的2.3 倍；
[0019]优选地，洗脱操作中所用乙酸乙酯与石油醚按体积比为1：5混合后 使用。
[0020]本申请的另一方面还提供了一种三唑醇含量检测用抗原，为由如上述 半抗原与载体蛋白偶联得到的偶联物。
[0021]优选地，所述载体蛋白为牛血清白蛋白或卵清蛋白；
[0022]所述抗原的制备方法包括：免疫原制备和包被原制备；
[0023]优选地，所述免疫原制备为三唑醇半抗原与牛血清白蛋白偶联得到免 疫原。
[0024]优选地，所述包被原制备为取所述半抗原9.17mg，加1mlDMF溶解 澄清，加NHS5.3mg，EDC11.4mg，充分溶解混匀，室温反应2h，得到半 抗原活化液A液；取卵清白蛋白50mg，加0.1M CB9.14ml溶解，得到B 液，将A液逐滴滴加到B液中，室温反应6h，停止反应，0.02M PBS透 析纯化3天，每天换液3次，离心分装，得到三唑醇
‑
OVA偶联物，即为 包被原。
[0025]本申请的另一方面还提供了一种三唑醇含量检测用单克隆抗体，为由 如上述的抗原经动物免疫、细胞融合和克隆化、细胞冻存和复苏、单克隆 抗体的生产与纯化后得到的单克隆抗体；
[0026]所述单克隆抗体能与三唑醇发生特异性免疫反应。
[0027]本申请的另一方面还提供了一种三唑醇酶联免疫检测试剂盒，由：
[0028](1)包被如上述三唑醇含量检测用抗原的酶标板；
[0029](2)浓度分别为0μg/L、1μg/L、3μg/L、9μg/L、27μg/L的三唑醇标 准品溶液；
[0030](3)如上述三唑醇含量检测用单克隆抗体工作液；
[0031](4)底物显色液：A液为过氧化脲，B液为四甲基联苯胺；
[0032](5)2mol/L硫酸终止液；
[0033](6)洗涤液：pH值为7.4，含有0.5％～1.0％吐温
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20、0.01
‰
～0.03
‰
叠 氮化钠防腐剂、0.1～0.3mol/L的磷酸盐缓冲液，所述百分比为重量体积百 分比组成。
[0034]优选地，所述三唑醇酶联免疫试剂盒检测样本为经过预处理的烟草样 本。
[0035]本申请能产生的有益效果包括：
[0036]1)本申请所提供的三唑醇含量检测用半抗原，本申请提供半抗原制 成的试剂盒对三唑醇的检测浓度得到提高，达到2mg/kg，有效避免当三唑 醇浓度升高后，无法检测的情况，降低检测结果误差值。本申请的半抗原 对初烤烟叶回收率较高，最高可达105.9％，且批间相对标准偏差均小于 10％，说明采用该半抗原检测准确性得到提高，且可用于对初烤烟叶的准 确检测中。采用该半抗原对含4mg/kg三唑醇的待烤烟叶进行检测，平均回 收率高达87.2％，说明在检测上限得到提高的情况下，本申请提供半抗原 对高浓度三唑醇样本的检出准确率得到提高。本申请提供半抗原制成抗体 后，抗体的效价比1：(1000000
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3000000)，在本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种三唑醇含量检测用半抗原，其特征在于，化学式为：C
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H
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ClN3O6；分子式为：所述三唑醇含量检测用半抗原的制备方法，包括以下步骤：1)将叔丁基羟基三唑醇溶解后与(S)
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噁丙环乙酸乙酯、三乙胺、NaH搅拌混合，在油浴条件下加热至100℃进行亲核加成反应6小时后，停止反应；2)所得反应物经过萃取，合并所得有机相，旋蒸蒸干得到黄色油状物；3)添加乙醇溶解所得油状物后，加入KOH后室温条件搅拌进行水解反应3小时停止反应，经过提纯处理后得到半抗原。2.根据权利要求1所述的三唑醇含量检测用半抗原，其特征在于，所述步骤3)中所述提纯处理包括：对所得反应物依序进行旋蒸、除乙醇、萃取，将所得有机相蒸干后上硅胶柱，采用乙酸乙酯/石油醚进行洗脱分离，得到所述半抗原。3.根据权利要求2所述的三唑醇含量检测用半抗原，其特征在于，所述叔丁基羟基三唑醇、(S)
‑2‑
噁丙环乙酸乙酯、三乙胺、NaH按摩尔比为1：3：5：2混合；优选地，叔丁基羟基三唑醇溶液浓度为0.1037g/ml。4.根据权利要求2所述的三唑醇含量检测用半抗原，其特征在于，所述萃取步骤中所用萃取剂为水、乙酸乙酯，水：乙酸乙酯按体积比为1：0.5～0.8添加；萃取操作重复进行三次；优选地，步骤3)中KOH的添加量为叔丁基羟基三唑醇摩尔数的2.3倍；优选地，洗脱操作中所用乙酸乙酯与石油醚按体积比为1：5混合后使用。5.一种三唑醇含量检测用抗原，其特征在于，为由如权利要求1～4中任一项所述半抗原与载体蛋白偶联得到的偶联物。6.根据权利要求5所述的三唑醇含量检测用抗原，其特征在于，所述载体蛋白为牛血清白蛋白或卵清蛋白；所述抗原的制备方法包括：...

【专利技术属性】
技术研发人员：王春琼，陈丹，孙浩巍，张轲，李超，张晓伟，蔡洁云，徐安传，秦世春，叶灵，龙杰，曾彦波，张燕，杨艺敏，张庆刚，
申请(专利权)人：云南省烟草质量监督检测站，
类型：发明
国别省市：