液相色谱-质谱在线蛋白质分离分析装置及其使用方法制造方法及图纸

本发明专利技术公开了一种液相色谱

【技术实现步骤摘要】
液相色谱
‑
质谱在线蛋白质分离分析装置及其使用方法


[0001]本专利技术属于生物样本的分析鉴别仪器
，具体涉及一种液相色谱
‑
质谱在线蛋白质分离分析装置及其使用方法。

技术介绍

[0002]高效液相色谱
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高分辨质谱(HPLC
‑
MS)在线分析技术在蛋白质组学分析中得到了广泛应用。基因组学研究揭示人类至少有22000种基因编码的蛋白质，考虑到每种蛋白质的后转录修饰可以高达10种以上，复杂的临床生物样本(例如血液样本或组织样本)包含的蛋白质种类多达数十万，而它们的浓度范围高达10
10
(例如血液中高浓度的mg/mL水平的白蛋白与低浓度的fg/mL水平的蛋白激酶)。
[0003]目前没有一种高效液相色谱分离技术可以将如此复杂生物样本中的蛋白质完全分离检测，比较高效的反相液相色谱可以从生物样本中分离得到100个蛋白质组分。因此即使不考虑蛋白质的后转录修饰，即每个组分中含有的蛋白质也高达220种！为了改善蛋白质高效液相色谱分离效能，相继开发了3种二维正交高效液相色谱分离技术，例如阳离子交换色谱
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反相色谱、阴离子交换色谱
‑
反相色谱和空间排阻色谱
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反相色谱。以阴离子交换色谱
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反相色谱为例，若阴离子交换色谱可以分离得到10个蛋白质组分，每一个组分经反相色谱分离出100个蛋白质组分，则该二维高效液相色谱分离系统可以分离出1000(即10
×<br/>100)个蛋白质组分，每个组分含有22种蛋白质(在没有考虑蛋白质发生后转录修饰的前提下)。然而，现有的二维高效液相色谱分离系统存在以下主要不足：
[0004]①
由于这些二维高效液相色谱分离系统中的第一维色谱分离技术采用的是含有不挥发性盐(例如氯化钠或磷酸盐)的缓冲溶液为流动相，从第一维液相色谱分离出来的蛋白质组分在第二维反相液相色谱分离时，必须进行脱盐以保证第二维反相液相色谱分离效能。然而，残留含盐组分(例如氯化钠或磷酸盐)在反相色谱柱内的积累严重影响反相色谱的分离效能和反相色谱柱的使用寿命。
[0005]②
脱盐过程中从反相色谱柱流出的含盐溶液极大抑制电喷雾离子化质谱(electrospray ionization mass spectrometry,ESI
‑
MS)的离子化效率而降低了质谱分析的灵敏度。
[0006]③
不挥发性盐(例如氯化钠或磷酸盐)组分进入质谱仪器并对仪器内部部件造成严重污染而增加了质谱仪器清洗次数和缩短了其使用寿命。
[0007]上述原因限制了这些二维高效液相色谱分离系统与质谱在线联用分析检测复杂生物样本中的蛋白质组分。因此，亟需建立一种与电喷雾质谱(ESI
‑
MS)在线联用分析兼容的二维高效液相色谱分离系统并应用于复杂生物样本中的蛋白质分析。

技术实现思路

[0008]本申请的主要目的在于提供一种适用于血液、尿液和组织等复杂生物样本中蛋白质的二维正交高效液相色谱
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质谱在线联用分析检测蛋白质的分离分析装置及其使用方
法。
[0009]为了实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
[0010]本专利技术的第一方面，提供了一种液相色谱
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质谱在线蛋白质分离分析装置，包括自动进样器，第一色谱泵，离子交换色谱柱，切换阀，第二色谱泵，反相色谱柱，质谱仪，截止阀，第一废液瓶和第二废液瓶；
[0011]流动相在第一色谱泵的作用下流经自动进样器，由自动进样器流出的溶液进入离子交换色谱柱，从离子交换色谱柱流出的溶液经切换阀流入反相色谱柱，经反相色谱柱流出的液体经三通分别流入质谱仪和截止阀，所述截止阀与所述第一废液瓶相连通；
[0012]流动相在第二色谱泵的作用下流经切换阀；所述第二废液瓶与所述切换阀相连通。
[0013]上述一种液相色谱
‑
质谱在线蛋白质分离分析装置，作为一种优选的实施方案，所述切换阀为6
‑
port
‑2‑
position切换阀，所述截止阀为6
‑
port
‑2‑
position截止阀。
[0014]上述一种液相色谱
‑
质谱在线蛋白质分离分析装置，作为一种优选的实施方案，所述自动进样器包括进样泵、进样阀、进样针、样本环和样本盘，所述进样阀为6
‑
port
‑2‑
position进样阀；
[0015]所述进样泵与进样阀的进口3相连通，所述进样针的一端与所述进样阀的进口4相连通，所述进样针的另一端与所述样本盘相连通；所述样本环的两端分别与所述进样阀的进口2和进样阀的进口5相连通。
[0016]上述一种液相色谱
‑
质谱在线蛋白质分离分析装置，作为一种优选的实施方案，所述第一色谱泵与所述进样阀的进口1相连通，所述进样阀的出口6与所述离子交换色谱柱的进口相连通；
[0017]所述离子交换色谱柱的出口与所述切换阀的进口2相连通，所述切换阀的出口3与所述反相色谱柱的进口相连通，所述反相色谱柱的出口经三通分别与质谱仪和截止阀的进口2相连通，所述截止阀的出口3与所述第一废液瓶相连通，所述截止阀的出口1处设置有堵头。
[0018]上述一种液相色谱
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质谱在线蛋白质分离分析装置，作为一种优选的实施方案，所述第二色谱泵与所述切换阀的进口4相连通，所述切换阀的出口1和出口5均与第二废液瓶相连通。
[0019]上述一种液相色谱
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质谱在线蛋白质分离分析装置，作为一种优选的实施方案，所述离子交换色谱柱的规格为：1.0mm ID
×
10cm Length，所述离子交换色谱柱的固定相为POROS 50HQ/HS填料，粒度20mm，(Applied Biosystems)；所述反相色谱柱的规格为：1mm ID
×
15cm Length，所述反相色谱柱的固定相为POROS R2填料，粒度20um，(Applied Biosystems)。
[0020]上述一种液相色谱
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质谱在线蛋白质分离分析装置，作为一种优选的实施方案，所述质谱仪所含电喷雾喷针的内径为20um；连通三通和质谱仪的管道的内径为20um，连通三通和截止阀进口2的管道的内径为762um，连通截止阀进口2和截止阀出口3，及连通截止阀出口3和第一废液瓶的管道的内径均为762um。
[0021]本申请所采用的质谱仪可为任何商品化电喷雾离子化质谱，包括四级杆
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飞行时间质谱、四级杆
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轨道阱质谱、离子阱质谱等，电喷雾喷针的内径为20um ID
×
10cm Length，
喷针尖端内径为10mm。
[0022]本申请的第二方面本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种液相色谱
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质谱在线蛋白质分离分析装置，其特征在于，包括自动进样器，第一色谱泵，离子交换色谱柱，切换阀，第二色谱泵，反相色谱柱，质谱仪，截止阀，第一废液瓶和第二废液瓶；流动相在第一色谱泵的作用下流经自动进样器，由自动进样器流出的溶液进入离子交换色谱柱，从离子交换色谱柱流出的溶液经切换阀流入反相色谱柱，经反相色谱柱流出的液体经三通分别流入质谱仪和截止阀，所述截止阀与所述第一废液瓶相连通；流动相在第二色谱泵的作用下流经切换阀；所述第二废液瓶与所述切换阀相连通。2.根据权利要求1所述液相色谱
‑
质谱在线蛋白质分离分析装置，其特征在于，所述切换阀为6
‑
port
‑2‑
position切换阀，所述截止阀为6
‑
port
‑2‑
position截止阀；所述自动进样器包括进样泵、进样阀、进样针、样本环和样本盘，所述进样阀为6
‑
port
‑2‑
position进样阀；所述进样泵与进样阀的进口3相连通，所述进样针的一端与所述进样阀的进口4相连通，所述进样针的另一端与所述样本盘相连通；所述样本环的两端分别与所述进样阀的进口2和进样阀的进口5相连通。3.根据权利要求3所述液相色谱
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质谱在线蛋白质分离分析装置，其特征在于，所述第一色谱泵与所述进样阀的进口1相连通，所述进样阀的出口6与所述离子交换色谱柱的进口相连通；所述离子交换色谱柱的出口与所述切换阀的进口2相连通，所述切换阀的出口3与所述反相色谱柱的进口相连通，所述反相色谱柱的出口经三通分别与质谱仪和截止阀的进口2相连通，所述截止阀的出口3与所述第一废液瓶相连通，所述截止阀的出口1处设置有堵头；所述第二色谱泵与所述切换阀的进口4相连通，所述切换阀的出口1和出口5均与第二废液瓶相连通。4.根据权利要求1所述液相色谱
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质谱在线蛋白质分离分析装置，其特征在于，所述离子交换色谱柱的规格为：1.0mm ID
×
10cm Length，所述离子交换色谱柱的固定相为POROS 50HQ/HS填料；所述反相色谱柱的规格为：1mm ID
×
15cm Length，所述反相色谱柱的固定相为POROS R2填料。5.根据权利要求1所述液相色谱
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质谱在线蛋白质分离分析装置，其特征在于，所述质谱仪所含电喷雾喷针的内径为20um；连通三通和质谱仪的管道的内径为20um，连通三通和截止阀进口2的管道的内径为762um，连通截止阀进口2和截止阀出口3，及连通截止阀出口3和第一废液瓶的管道的内径均为762um。6.权利要求1
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5任一项所述液相色谱
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质谱在线蛋白质分离分析装置的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)上样和平衡色谱柱：调整进样阀，使进样阀的进口3、进样阀的进口2、进样阀的进口5和进样阀的进口4依次相连通，进样阀的进口1和进样阀的出口6相连通；调整切换阀，使切换阀的出口1和切换阀的进口6相连通，使切换阀的进口2和切换阀的出口3相连通，使切换阀的进口4和切换阀的出口5相连通；调整截止阀，使截止阀的出口1和进口6相连通；使截止阀的进口2和截止阀的出口3相连通，使截止阀的进口4和截止阀的进口5相连通；
在进样泵的作用下，进样针从样本盘中吸取样本至样本环；在第一色谱泵的作用下，第一流动液对离子交换色谱柱和反相色谱柱进行平衡，第一流动液的流速为100ul/min；在第二色谱泵的作用下，第二流动液对切换阀进行冲洗，第二流动液的流速为50ul/min；(2)样本富集和脱盐：调整进样阀，使进样阀的进口1、进样阀的进口2、进样阀的进口5和进样阀的出口6依次相连通，使进样阀的进口3和进样阀的进口4相连通；调整切换阀，使切换阀的出口1和切换阀的进口6相连通，使切换阀的进口2和切换阀的出口3相连通，使切换阀的进口4和切换阀的出口5相连通；调整截止阀，使截止阀的出口1和进口6相连通；使截止阀的进口2和截止阀的出口3相连通，使截止阀的进口4和截止阀的进口5相连通；在第一色谱泵的作用下，将第一流动液泵入进样阀并将样本环内的样本推出上样至离子交换色谱柱，第一流动液的流速为50ul/min；在第二色谱泵的作用下，将第二流动液泵入切换阀，第二流动液的流速为50ul/min；(3)上pH梯度洗脱液和色谱柱脱盐；调整进样阀，使进样阀的进口3、进样阀的进口2、进样阀的进口5和进样阀的进口4依次相连通，进样阀的进口1和进样阀的出口6相连通；调整切换阀，使切换阀的出口1和切换阀的进口6相连通，使切换阀的进口2和切换阀的出口3相连通，使切换阀的进口4和切换阀的出口5相连通；调整截止阀，使截止阀的出口1和进口6相连通；使截止阀的进口2和截止阀的出口3相连通，使截止阀的进口4和截止阀的进口5相连通；在进样泵的作用下，进样针从样本盘中吸取pH梯度洗脱液至样本环；在第一色谱泵的作用下，第一流动液对离子交换色谱柱和反相色谱柱进行脱盐，第一流动液的流速为100ul/min；在第二色谱泵的作用下，第二流动液对切换阀进行冲洗，第二流动液的流速为50ul/min；(4)pH梯度洗脱和色谱柱脱盐：调整进样阀，使进样阀的进口1、进样阀的进口2、进样阀的进口5和进样阀的出口6依次相连通，使进样阀的进口3和进样阀的进口4相连通；调整切换阀，使切换阀的出口1和切换阀的进口6相连通，使切换阀的进口2和切换阀的出口3相连通，使切换阀的进口4和切换阀的出口5相连通；调整截止阀，使截止阀的出口1和进口6相连通；使截止阀的进口2和截止阀的出口3相连通，使截止阀的进口4和截止阀的进口5相连通；在第一色谱泵的作用下，将第一流动液泵入进样阀并将样本环内的pH梯度洗脱液推出上样至离子交换色谱柱，第一流动液的流速为50ul/min；在第二色谱泵的作用下，将第二流动液泵入切换阀，第二流动液的流速为50ul/min；(5)上pH梯度洗脱液和反相色谱分离梯度洗脱：调整进样阀，使进样阀的进口3、进样阀的进口2、进样阀的进口5和进样阀的进口4依次
相连通，进样阀的进口1和进样阀的出口6相连通；调整切换阀，使切换阀的出口1和切换阀的进口2相连通，使切换阀的出口3和切换阀的进口4相连通，使切换阀的出口5和切换阀的进口6相连通；调整截止阀，使截止阀的出口1和截止阀的进口2相连通，使截止阀的进口5和截止阀的进口6相连通，使截止阀的出口3和截止阀的进口4相连通；在进样泵的作用下，进样针从样本盘中吸取...

【专利技术属性】
技术研发人员：高俊顺，高俊莉，王洪，江南，宋林珍，凌欢君，
申请(专利权)人：杭州广科安德生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：