一种液相色谱质谱法测定畜禽粪便中抗球虫药含量的方法技术

本发明专利技术的一种液相色谱质谱法测定畜禽粪便中抗球虫药含量的方法，包括(1)在畜禽粪便中加入混合标准工作液，静置；(2)加入乙酸乙腈溶液，涡旋、超声、震荡、离心提取；(3)加入乙腈饱和的正己烷，除去脂类物；取提取清液转移至提前装有50mg PSA和50mg C

【技术实现步骤摘要】
一种液相色谱质谱法测定畜禽粪便中抗球虫药含量的方法


[0001]本专利技术属于畜禽粪便中微量有机污染物质残留检测
，涉及一种用于畜禽粪便中抗菌药检测的方法，特别涉及一种分散固相萃取前处理结合超高效液相色谱串联质谱技术(UPLC
‑
MS/MS)，能够高效处理并同时检测畜禽粪便中8种抗球虫药的方法。

技术介绍

[0002]自我国发布“禁抗”行动以来，促生长类的抗菌药完全被禁止使用。但是在减抗和禁抗的背景下，难免有不法份子利用此特性造成抗球虫药的滥用。此外，畜禽养殖过程中球虫病的预防必不可少，抗球虫药的联合和穿梭使用，不按规定用药等都会造成此类药物的蓄积。抗球虫药很少被吸收，大多以原型排出体外，规模化养殖场的粪便大多用于农作物的灌溉，药物的残留就会随之进入生态环境。畜禽粪便机制本身是一种复杂的环境样品，有效的样品提取和净化是准确测定其中抗球虫含量的前提。因此，畜禽粪便中残留的多种抗球虫药的同时测定方法研究尤为重要。
[0003]目前，传统的抗球虫药的检测方法主要为酶联免疫吸附测定法、免疫层析试纸法及毛细管电泳法等，酶联免疫吸附测定法稳定性差，免疫层析试纸法和毛细管电泳法虽然快速且效率高，但是检测样品相对单一。因此在一定程度上制约了畜禽粪便中抗球虫药残留研究的进展。
[0004]超声萃取、HLB固相萃取柱净化前处理结合超高效液相色谱串联质谱技术UPLC
‑
MS/MS具有应用范围广、分离效率高、特异性强和灵敏度高等优点，目前已成为有机物预处理和分析的重要方法之一。但现有的超声萃取、HLB固相萃取柱净化前处理结合超高效液相色谱串联质谱用于畜禽粪便中抗球虫药的检测时，大多由于提取方法、提取溶剂选用不合适，或固相萃取前处理条件、液相色谱条件和/或质谱条件选择不当，或多或少存在着检测结果不稳定、干扰多、检测抗生素数量和回收率有限等问题。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的旨在通过构建超高效液相方法检测畜禽粪便中莫能菌素、盐霉素、氯苯胍、磺胺喹噁啉、氯羟吡啶、地克珠利、尼卡巴嗪和二硝托胺的含量。
[0006]本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的：
[0007]一种液相色谱质谱法测定畜禽粪便中抗球虫药含量的方法，采用超声萃取
‑
分散固相萃取前处理结合超高效液质联用技术同时检测畜禽粪便中8种抗球虫药物，具体包括以下步骤进行：
[0008](1)在2g
±
0.01g畜禽粪便中加入按需称取0.1
‑
250μg/kg的混合标准工作液，混匀，静置20min，待提取；
[0009](2)加入5mL 2％乙酸乙腈溶液，涡旋1min，超声10min，震荡20min，10000rpm离心10min，充分提取两次，合并两次提取清液，待净化；
[0010](3)加入等比的乙腈饱和的正己烷，除去溶解在提取液中的脂类物质；再取步骤2
中合并后的清液转移至提前装有50mg PSA和50mg C
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填料的离心管中，涡旋1min，10000rpm离心10min，取上清液；
[0011](4)取净化后的2mL溶液置于玻璃管中，吹干，用1mL甲醇
‑
含0.1％甲酸水5：5溶液复溶，将其置于
‑
20℃2h，4℃冷冻离心，10000rpm离心5min，经0.22μm滤膜过滤，待检测；
[0012](5)使用Agilent 1260高效液相色谱系统进行分析，色谱分离选用ACQUITYBEH
‑
C
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色谱柱作为分析柱，柱温为30℃；流动相A为0.1％甲酸水，B为甲醇，梯度洗脱；流速0.5mL/min；进样量5μL；参见8种目标分析物的质谱参数，计算含量；
[0013]其质谱条件：电喷雾电离正离子模式为Electrospray ionization positive mode,ESI+/负离子模式为Electrospray ionization negative ion mode,ESI
‑
，多反应监测模式为Multiple
‑
reaction monitoring，MRM；毛细管电压：3.00kV；锥孔电压：30V；离子源和离子化溶剂温度分别为150℃和500℃；离子化气体流量：1000L/h；锥孔气流速50L/h；去溶剂气体为氮气，碰撞气体为氩气。
[0014]所述标准工作液为称取0.01g二硝托胺、盐霉素和莫能菌素对照品，置于10mL容量瓶中，用乙腈溶解配制成1mg/mL的标准储备液；分别称取0.01g氯羟吡啶、尼卡巴嗪、磺胺喹噁啉、氯苯胍和地克珠利对照品，置于10mL容量瓶，用1mL二甲基亚砜完全溶解后用乙腈定容至10mL配制成1mg/mL的标准储备液；标准储备液置于
‑
20℃避光保存，有效期6个月。将标准储备液稀释后，分别准确移取1mL于10mL容量瓶中用色谱乙腈定容，配制成100μg/mL的标准工作液，于
‑
20℃避光保存，有效期1个月。根据需要用色谱甲醇
‑
含0.1％甲酸水溶液8:2逐级稀释配成50、20、10、5μg/mL的标准工作液，现配现用。
[0015]所述ACQUITYBEH
‑
C
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色谱柱：2.1mm
×
50mm i.d.,1.7μm。
[0016]所述梯度洗脱程序为0.1％甲酸水A和甲醇B：10％B，0～2min；10％～80％B，2～6min；80％～95％B，6～8min；95％B，8～9min；95％～10％B，9～10min。
[0017]所述8种目标分析物为莫能菌素、盐霉素、氯苯胍、磺胺喹噁啉、氯羟吡啶、地克珠利、尼卡巴嗪和二硝托胺。
[0018]本专利技术旨在建立一种新的、简便的、重复性好的超高效液相色谱串联质谱检测法快速测定畜禽粪便中8种抗球虫药的分析方法。
附图说明
[0019]图1是不同提取液的对抗球虫药物的提取回收率的影响；
[0020]其中：MON为莫能菌素，SAL为盐霉素，ROB为氯苯胍，SQX为磺胺喹噁啉，CLOP为氯羟吡啶，DZL为地克珠利，NIC为尼卡巴嗪，DIN为二硝托胺。
[0021]图2是不同净化条件对鸡粪便中抗球虫药物的净化影响；
[0022]其中：MON为莫能菌素，SAL为盐霉素，ROB为氯苯胍，SQX为磺胺喹噁啉，CLOP为氯羟吡啶，DZL为地克珠利，NIC为尼卡巴嗪，DIN为二硝托胺。
[0023]图3是添加浓度为100ng/kg的空白粪便和空白粪便提取液的典型色谱图；
[0024]其中：MON为莫能菌素，SAL为盐霉素，ROB为氯苯胍，SQX为磺胺喹噁啉，CLOP为氯羟吡啶，DZL为地克珠利，NIC为尼卡巴嗪，DIN为二硝托胺。A1,A2列：空白鸡粪便，B1,B2列:对应的鸡粪便。
[0025]图4是抗球虫药在鸡本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种液相色谱质谱法测定畜禽粪便中抗球虫药含量的方法，采用超声萃取
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分散固相萃取前处理结合超高效液质联用技术同时检测畜禽粪便中8种抗球虫药物，其特征在于：具体包括以下步骤进行：(1)在2g
±
0.01g畜禽粪便中加入按需称取0.1
‑
250μg/kg的混合标准工作液，混匀，静置20min，待提取；(2)加入5mL 2％乙酸乙腈溶液，涡旋1min，超声10min，震荡20min，10000rpm离心10min，充分提取两次，合并两次提取清液，待净化；(3)加入等比的乙腈饱和的正己烷，除去溶解在提取液中的脂类物质；再取步骤2中合并后的提取清液转移至提前装有50mg PSA和50mg C
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填料的离心管中，涡旋1min，10000rpm离心10min，取上清液；(4)取净化后的2mL溶液置于玻璃管中，吹干，用1mL甲醇
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含0.1％甲酸水5：5溶液复溶，将其置于
‑
20℃2h，4℃冷冻离心，10000rpm离心5min，经0.22μm滤膜过滤，待检测；(5)使用Agilent 1260高效液相色谱系统进行分析，色谱分离选用ACQUITYBEH
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C
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色谱柱作为分析柱，柱温为30℃；流动相A为0.1％甲酸水，B为甲醇，梯度洗脱；流速0.5mL/min；进样量5μL；参见8种目标分析物的质谱参数，计算含量；其质谱条件：电喷雾电离正离子模式为Electrospray ionization positive mode,ESI+/负离子模式为Electrospray ionization negative ion mode,ESI
‑
，多反应监测模式为Multiple
‑
reaction monitoring，...

【专利技术属性】
技术研发人员：吕世明，唐浩岚，宋旭琴，廖书丹，
申请(专利权)人：贵州大学，
类型：发明
国别省市：