多糖活化度的测定方法技术

本发明专利技术公开了一种多糖活化度的测定方法，包括如下步骤：对供试品进行预处理：取部分作为第一样品，并获得第一样品中多糖含量，记为m；另取一部分进行酸水解处理，得到第二样品；依据DMAP对照样品获得关于DMAP的峰面积

【技术实现步骤摘要】
多糖活化度的测定方法


[0001]本专利技术是关于多糖活化度测定领域，特别是关于一种多糖活化度的测定方法。

技术介绍

[0002]肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)作为兼性厌氧革兰氏阳性菌，是引起获得性肺炎、鼻窦炎、中耳炎、脑膜炎和菌血症等严重疾病的重要病菌，荚膜多糖是其致病的主要毒力因子。疫苗是预防肺炎链球菌感染最有效的手段。多糖疫苗虽有在人体内直接诱导B细胞产生抗体，但由于荚膜多糖是T细胞非依赖性抗原(TI
‑
Ag),不能对2岁以下的婴幼儿激发保护性免疫反应，也不能产生免疫记忆，故肺炎多糖疫苗只能用于2岁以上的儿童和成人。荚膜多糖在免疫原性上的这种局限性可以通过给荚膜多糖引入载体蛋白质，即将荚膜多糖与载体蛋白共价交联，使其转化为T细胞依赖性抗原(TD
‑
Ag)来解决，从而产生保护性T细胞依赖性记忆反应。
[0003]荚膜多糖在与载体蛋白结合之前需要进行活化，1
‑
氰基
‑4‑
二甲氨基
‑
吡啶四氟化硼(1
‑
cyano
‑4‑
dimethy
‑
laminopyridinium tetrafluoroborate，CDAP)是一种可用于异脲键连接反应中多糖活化的试剂，活化后的肺炎链球菌荚膜多糖具有吡啶异脲结构。CDAP虽能在水溶液的环境中活化荚膜多糖，但在水溶液中并不稳定，在中性水溶液中数小时即降解，而在碱性水溶液中则会迅速降解，CDAP的降解产物为4
‑
二甲氨基吡啶(DMAP)，会影响测定肺炎链球菌活化荚膜多糖活化度的准确性。
[0004]免疫原性是多糖结合疫苗质量评判的一个重要方面。通过肺炎球菌活化多糖的活化度数据来评定肺炎球菌多糖结合疫苗的衍化率，从而作为肺炎球菌多糖结合疫苗免疫原性的一种质控方法。因此，有必要提供一种多糖活化度的测定方法来测定肺炎链球菌活化荚膜多糖的活化度。本方法具体通过优化活化条件，控制活化度达到较高的衍化率，减少游离多糖的含量，使肺炎球菌多糖结合疫苗达到更好的免疫原性
[0005]公开于该
技术介绍
部分的信息仅仅旨在增加对本专利技术的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供一种多糖活化度的测定方法，其能够有效填补肺炎链球菌活化荚膜多糖活化度测定方面的空白。
[0007]为实现上述目的，本专利技术的实施例提供了一种多糖活化度的测定方法,包括如下步骤：
[0008]对供试品进行预处理：取部分作为第一样品，并获得第一样品中多糖含量，记为m；另取一部分进行酸水解处理，得到第二样品；
[0009]依据DMAP对照样品获得关于DMAP的峰面积
‑
含量标准线性回归方程；
[0010]在同等条件下对第二样品进行处理得到对应的DMAP的峰面积，并通过DMAP的峰面积
‑
含量标准线性回归方程获得第二样品中的DMAP含量，记为n；
[0011]依据第二样品中的DMAP含量和第一样品中的多糖含量，获得所述供试品的活化度。
[0012]在本专利技术的一个或多个实施方式中，所述供试品的预处理包括透析处理。
[0013]在本专利技术的一个或多个实施方式中，所述透析处理的时间为16
‑
24h。
[0014]在本专利技术的一个或多个实施方式中，所述酸水解溶液包括盐酸溶液，且盐酸溶液的浓度为0.15
‑
0.22μmol/ml。
[0015]在本专利技术的一个或多个实施方式中，所述酸水解时间为0.5
‑
6h。
[0016]在本专利技术的一个或多个实施方式中，所述酸水解的温度为20
‑
22℃。
[0017]在本专利技术的一个或多个实施方式中，所述第二样品处理还包括过滤。
[0018]在本专利技术的一个或多个实施方式中，所述过滤包括滤膜过滤，所述滤膜的孔径包括0.22、0.3、0.4和0.45μm。
[0019]在本专利技术的一个或多个实施方式中，测量所述第二样品中DMAP含量的方法包括RP
‑
HPLC法。
[0020]在本专利技术的一个或多个实施方式中，所述供试品的活化度的计算公式如下：
[0021]活化度(％)＝n*122*a/m
×
100％，
[0022]其中，122为DMAP相对分子量，a为透析后的供试品在酸水解处理时的稀释倍数。
[0023]与现有技术相比，根据本专利技术实施方式的多糖活化度的测定方法，通过透析和酸处理，以及DMAP对照样品标准线性方程的获得和使用，使得肺炎链球菌活化荚膜多糖活化度的测定更加准确。
具体实施方式
[0024]下面对本专利技术的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本专利技术的保护范围并不受具体实施方式的限制。
[0025]除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的组成部分，而并未排除其它组成部分。
[0026]样品处理探究
[0027]活化多糖里游离的DMAP为小分子物质，可以通过超滤离心和透析两个方法去除，超滤离心过程样品的溶液体系会发生变化，影响样品的稳定性，且不能一次性完全去除游离的DMAP，多次超滤离心会使活化多糖发生交联，导致多糖吸附在滤膜上使糖含量降低，故选用透析的方式去除游离的DMAP。
[0028](1)透析时间的探究。通过取透析液中DMAP含量来检测透析的程度：取10ml活化糖放入1L的纯化水中透析且每2h换一次液，分别取透析2h、4h、6h、8h和10h的透析液测定DMAP含量，分别为9.198μmol/ml、0.248μmol/ml、0.418μmol/ml、0.113μmol/ml、0.128μmol/ml，透析过后取22h和24h透析液测DMAP含量为0.083μmol/ml、0.062μmol/ml，初步认为24h基本可以去除游离的DMAP。对透析时间进行进一步确认，取10ml样品放入1L的纯化水中透析，取透析4h、16h、18h和20h透析液测DMAP含量，结果分别为0.189μmol/ml、0.005μmol/ml、0.002μmol/ml和未检出，故最终确定将透析时间定为16
‑
24h。
[0029](2)透析时间确认。透析处理活化多糖样品时，每隔2
‑
3h换一次透析液，透析过夜
后再换一次透析液透析2h以上取透析液测DMAP含量。若检测结果低于检测限，认为透析结束；若检测结果大于检测限，则继续透析1
‑
2h后再次取样检测，直至DMAP含量随透析时间延长结果无变化认为透析结束。
[0030]盐酸参数的选择
[0031]盐酸水解浓度：选本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种多糖活化度的测定方法，其特征在于，包括如下步骤：对供试品进行预处理：取部分作为第一样品，并获得第一样品中多糖含量，记为m；另取一部分进行酸水解处理，得到第二样品；依据DMAP对照样品获得关于DMAP的峰面积
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含量标准线性回归方程；在同等条件下对第二样品进行处理得到对应的DMAP的峰面积，并通过DMAP的峰面积
‑
含量标准线性回归方程获得第二样品中的DMAP含量，记为n；依据第二样品中的DMAP含量和第一样品中的多糖含量，获得所述供试品的活化度。2.如权利要求1所述的多糖活化度的测定方法，其特征在于，所述供试品的预处理包括透析处理。3.如权利要求2所述的多糖活化度的测定方法，其特征在于，所述透析处理的时间为16
‑
24h。4.如权利要求1所述的多糖活化度的测定方法，其特征在于，所述酸水解溶液包括盐酸溶液，且盐酸溶液的浓度为0.15
‑
0.22...

【专利技术属性】
技术研发人员：张凡，曹方，喻峥嵘，王玲，顾芸菲，蒋苏，
申请(专利权)人：艾美探索者生命科学研发有限公司，
类型：发明
国别省市：