一种检测辣椒轻斑驳病毒和炭疽菌的引物组、试剂盒及方法技术

本发明专利技术涉及植物病毒、病菌生物检测技术领域，具体涉及一种基于重组酶介导等温核酸扩增技术(RT

【技术实现步骤摘要】
一种检测辣椒轻斑驳病毒和炭疽菌的引物组、试剂盒及方法


[0001]本专利技术涉及植物病毒、病菌生物检测
，具体涉及一种基于重组酶介导等温核酸扩增技术(RT
‑
RAA)检测辣椒轻斑驳病毒和炭疽菌的引物组、试剂盒及方法。

技术介绍

[0002]辣椒轻斑驳病毒(Peppermild mottlevis，PMMoV)是帚状病毒科(Virgaviridae)烟草花叶病毒属(Tobamovirus)的无包膜正单链RNA病毒，可导致辣椒果实褪绿斑驳、畸形，在世界范围内对辣椒生产造成严重的经济损失。辣椒叶片在被侵染后或表现症状不明显，或出现褪绿斑驳和花叶症状；植株生长明显变缓，发病越早，长势受影响越大；果实被侵染后的症状较为明显，表现为果小、果面有褪绿斑驳、凹凸斑点、甚至出现畸形与坏死现象。1964年在美国首次报道PMMoV，随着种子贸易和种质资源交流的日益频繁，其分布范围也在逐年扩大。PMMoV有很大的潜在传播性，可通过汁液摩擦传播和种子传播，随带病的辣椒进入人体，经过消化排出人体后，仍具有侵染活性。国内北京地区市售辣椒商品种子阳性检出率高达61.11％。除辣椒外，发PMMoV还能自然侵染茄科的番茄，葫芦科的南瓜、黄瓜、西葫芦、甜瓜，豆科的豇豆等作物，而且在江苏葫芦科蔬菜样品中检出率为83.33％，并与其他病毒发生复合侵染的频率高且范围广，危害很大。目前对于PMMoV的检测方法主要有生物学方法、电镜技术、血清学测定法(酶联免疫吸附测定)和以核酸为基础的分子生物学测定法(RT
‑
PCR和实时荧光RT
‑
PCR法)，以酶联免疫吸附测定法(ELISA)和RT
‑
PCR法最为常用。另外还建立了通过反转录结合环介导的等温扩增(Loop
‑
mediated isothermal amplification，LAMP)检测PMMoV的方法。
[0003]辣椒炭疽病由半知菌亚门(Deuteromycotina)刺盘孢属(Colletotrichum)不同种引起的全球性真菌性病害。炭疽菌以菌丝体或分生孢子潜伏在种子内部或者表面上越冬，借雨水、昆虫或气流传播至寄主植物，经寄主伤口侵入，引起初次侵染，成为下季发病的初侵染源，继而长出分生孢子，可引起再次侵染。病菌侵入3～5天即可发病。高温高湿有利于病害的发生，可造成辣椒大面积减产。辣椒炭疽病主要为害叶片和果实。主要表现症状叶片染病多发生在成熟的叶片上，产生水浸状黄褐色圆形斑，果实上为褐色圆形或不规则的病斑。辣椒炭疽病在世界范围内均有发生，在中国、印度、印度尼西亚、韩国等地区常导致辣椒减产30％～40％，泰国减产最严重年份高达80％。已报道的辣椒炭疽病的病原菌主要为胶孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporoides)、黑色炭疽菌(Colletotrichum nigrum)、黑点炭疽菌(Colletotrichum capsici)、尖孢炭疽菌(Colletotrichum acutatum)等。对于炭疽菌的检测方法主要有生物学方法和以核酸为基础的分子生物学测定法(PCR、实时荧光PCR和LAMP)，以PCR和LAMP法最为常用。
[0004]重组酶介导等温核酸扩增技术(Recombinase AidedAmplification)是近年开发的一种核酸扩增技术可在恒定的低温(39℃)下进行高特异性的DNA扩增，并在数分钟内达到可检测的水平。RT
‑
RAA/RAA产物可以通过琼脂糖凝胶电泳检测。侧向流试纸条(Lateral flow strip，LFS)，侧向免疫层析检测可用于检测包括抗生素、毒素、蛋白、多肽、DNA等多种
生物物质，它利用纯化抗体的能力，以高度特异性结合并协同移动通过薄膜，并与薄膜上的检测区段竞争或被薄膜上的检测区段捕获。侧向流试纸条是目前常用的快速检测方法之一，其具有操作简单、样品量少、检测快速、成本低等优点，已在医学、食品和环境等多个领域广泛应用。

技术实现思路

[0005]要解决的问题
[0006]目前对于辣椒轻斑驳病毒(Peppermild mottlevis，PMMoV)、辣椒炭疽病的分子生物学方法要么高度依赖训练有素的实验室技术人员，要么需要复杂且昂贵的实验室仪器或者检测操作过程繁琐，都难以脱离实验室环境，在田间条件下应用。另外，这两种病原物可感染辣椒及多种作物常见病原物，但目前的检测方法大多以其中的一种为鉴定靶标，难以在生产实践中对PMMoV和炭疽菌同时进行快速准确的鉴定，亟需建立一种快速、简便、准确的双重病原物检测方法。如果能建立PMMoV、炭疽菌的RT
‑
RAA/RAA双重等温核酸扩增体系并与侧向层析试纸条检测相结合，既能满足农户对病毒种类确定、针对性防治病害的迫切需求，也可以为国家农技服务部门、植物保护和植物检疫部门提供新的技术支撑。
[0007]技术方案
[0008]为了解决上述的技术问题，本专利技术的目的在于提供一种基于RT
‑
RAA检测PMMoV、炭疽菌的引物组、试剂盒及方法。
[0009]本专利技术的一个方面，本专利技术提供了一种检测辣椒轻斑驳病毒(PMMoV)和炭疽菌的RT
‑
RAA检测引物组，所述引物组包括辣椒轻斑驳病毒检测引物、炭疽菌检测引物、辣椒
[0010]轻斑驳病毒检测探针PM
‑
P3和炭疽菌检测检测探针CT
‑
P1；其中，
[0011]所述辣椒轻斑驳病毒检测引物包括正向引物PM
‑
CPF和反向引物PM
‑
CPR，
[0012]正向引物PM
‑
F2的序列为:5
′‑
CTGTGTACTTCGGCGTTAGGCAATCAG
‑3′
(SEQ ID NO.1)；
[0013]反向引物PM
‑
R2的序列为5
′‑
CATTCATGAGGTTACTTATACTGGCCC
‑3′
(SEQ ID NO.2)；
[0014]所述炭疽菌检测引物包括正向引物CT
‑
F1和反向引物CT
‑
R1，
[0015]正向引物CT
‑
F1的序列为:5
′‑
GTGAGATCCGTCGCTACCAGAAG
‑3′
(SEQ ID NO.4)；
[0016]反向引物CT
‑
R1的序列为:5
′‑
GCATAGGTTGGTGTCCTCAAAGAG
‑3′
(SEQ ID NO.5)。
[0017]作为优选，本专利技术所述引物组，所述辣椒轻斑驳病毒检测探针PM
‑
P3，其序列为5
′‑
GCACTTCTCGGAGCCTTTGATACTAGGHACAGGATAATAGAAGTT
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测辣椒轻斑驳病毒（PMMoV）和炭疽菌的RT
‑
RAA检测引物组，其特征在于，所述引物组包括辣椒轻斑驳病毒检测引物、炭疽菌检测引物、辣椒轻斑驳病毒检测探针PM
‑
P3和炭疽菌检测探针CT
‑
P1；其中，所述辣椒轻斑驳病毒检测引物包括正向引物PM
‑
F2和反向引物PM
‑
R2，正向引物PM
‑
F2的序列为5
´‑ꢀ
CTGTGTACTTCGGCGTTAGGCAATCAG
‑3´
，反向引物PM
‑
R2的序列为5
´‑ꢀ
CATTCATGAGGTTACTTATACTGGCCC
ꢀ‑3´
；所述炭疽菌检测引物包括正向引物CT
‑
F1和反向引物CT
‑
R1，正向引物CT
‑
F1的序列为: 5
´‑
GTGAGATCCGTCGCTACCAGAAG
‑3´
，反向引物CT
‑
R1的序列为:5
´‑
GCATAGGTTGGTGTCCTCAAAGAG
‑3´
。2.如权利要求1所述的引物组，其特在于，所述辣椒轻斑驳病毒检测探针PM
‑
P3，其序列为5
´‑ꢀ
GCACTTCTCGGAGCCTTTGATACTAGGHACAGGATAATAGAAGTT
‑3´
；所述炭疽菌检测检测探针CT
‑
P1，其序列为5
´‑
CTTCAAGTCCGATCTCCGCTTCCAGTCHTCCGCCATCGGTGCCCTTC
‑3´
；所述PMMoV的反向引物PM
‑
R2的5
´
端修饰有FITC，所述检测探针PM
‑
P3的5
´
端修饰有生物素，PM
‑
P3的3
´
端磷酸化修饰，H为四氢呋喃；所述炭疽菌反向引物CT
‑
R1的5
´
端修饰有地高辛，所述探针引物CT
‑
P1的5
´
端修饰有罗丹明，CT
‑
P1的3
´
端有磷酸化修饰，H为四氢呋喃。3.一种检测辣椒轻斑驳病毒（PMMoV）和炭疽...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋雪梅，燕飞，曹宇浩，严丹侃，韩科雷，
申请(专利权)人：宁波大学，
类型：发明
国别省市：