甲型流感病毒血凝素蛋白的单克隆抗体ZJU-A1A3及其在检测中的应用制造技术

本发明专利技术提供抗甲型流感病毒血凝素蛋白的单克隆抗体ZJU

【技术实现步骤摘要】
甲型流感病毒血凝素蛋白的单克隆抗体ZJU
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A1A3及其在检测中的应用


[0001]本专利技术属于生物
，涉及抗甲型流感(H1N1和H3N2)病毒血凝素蛋白单克隆抗体的制备及应用，是利用细胞工程、抗体工程技术，获得分泌抗血凝素蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞系，通过同品系的小鼠诱导腹水，制备抗血凝素蛋白的单克隆抗体ZJU
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A1A3，鉴定为IgG1、κ型，再通过亲和纯化、电泳、免疫等技术实现对该抗体的应用。

技术介绍

[0002]流行性感冒具有季节性和高传染性，由流感病毒引起，是人类健康的重大威胁。感染人类的流感病毒主要包括甲型(A)和乙型(B)流感病毒。在全世界范围内，每年约有5％
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15％的人群感染流感病毒，并且已导致多次致命的大流行，造成了数百万人的生命损失。突变毒株、新型重组毒株和耐药性毒株的不断出现对现有疫苗和小分子药物的应用造成威胁。当前与人类季节性流感感染密切相关的流感病毒主要有四种，包括两种甲型流感病毒(H1N1和 H3N2)和两种谱系的乙型流感病毒，而甲型流感在全球范围内引起的传染性更强，病死率更高。当前流感疫苗接种仍然是预防流感病毒感染的最佳方法。但是由于流感疫苗与流行病毒株的不匹配等原因，2004年至2015年期间流感疫苗针对H3N2亚型流感病毒感染的有效性仅为33％。2009年6月，世界卫生组织宣布甲型H1N1流感大流行正在进行。甲型H1N1流感的早期症状与普通流感相似，易被轻视，但病情可迅速进展，突然高热、肺炎，重者可以出现呼吸衰竭、多器官损伤，甚至死亡，病死率可达6％。因此快速明确实验室诊断、对流感病毒准确分型，可以加深临床对流感流行和致病力的认识，提高流感病例的诊疗效果。
[0003]当前甲型流感病毒感染的诊断方法主要包括病毒分离鉴定、血清学方法和分子生物学方法，如逆转录酶聚合酶链反应和实时定量聚合酶链反应。但是上述方法都需要特殊设备和条件，对于某些条件落后的地区并不适合。已有许多研究开发了针对不同亚型的特异性单克隆抗体，并试图将其用于临床检测。但是由于流感病毒的高频率抗原漂移或转移，经常会造成抗体逃逸，因此，能够结合多种病毒亚型，并能够弥补病毒高突变率的广谱抗体就具有重要的价值。因此，本专利技术旨在说明一株能同时结合H1N1和H3N2甲型流感病毒血凝素蛋白的特异性单克隆抗体，并将其与免疫荧光技术结合，可以对样本中甲型季节性流感(H1N1和H3N2)病毒株进行检测。
[0004]综上所述，开发能同时结合H1N1和H3N2亚型流感病毒的单克隆抗体，用于快速灵敏检测方法的建立迫在眉睫。基于以上背景，本项目选定血凝素蛋白为靶抗原，采用融合杂交瘤技术建立稳定分泌抗血凝素蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞系，并大量制备、纯化和鉴定这些单克隆抗体。该单克隆抗体的成功获得，为建立甲型季节性流感病毒诊断方法——基于免疫学技术的诊断奠定物质基础。同时对疾病发病机理、预后及疗效判定等方面的研究起到重要作用。
[0005]本专利技术用到杂交瘤细胞技术。该技术将免疫小鼠的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，以建立分泌均质抗体的杂交瘤细胞系，也称为单克隆抗体技术。该技术涉及到动物免疫、细
胞培养、细胞融合、细胞克隆培养和免疫测定等一系列方法。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是提供一种抗甲型流感病毒血凝素蛋白单克隆抗体，能识别H1N1和/或H3N2流感病毒。该单克隆抗体亚型为IgG1、κ型，命名为ZJU
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A1A3，能特异性识别流感病毒的血凝素蛋白，序列如下：
[0007]SEQ ID No.1
[0008]重链:DNA序列(351bp)
[0009]Signal sequence
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FR1
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CDR1
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FR2
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CDR2
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FR3
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CDR3
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FR4
[0010]CAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGAGCTGAGCTGATGAGGCCTGGGGCCTCAGTGAAGATATCCTGCAAGGCTACTGGCTACACAATCAGTAGCTAC TGGATAGAGTGGGTAAAGCAGAGGCCTGGACATGGCCTTGAGTGGATTGGAGAGATTTTACCTGGAAGTGGTAATACTAACTACAATGAGAAGTTC AAGGGCAAGGCCACATTCACTGCAGATACATCCTCCAACACAGCCTACATGCAACTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCCGTCTACTACTGT GCAAGGCCACGGGTCTATGGTTTGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA
[0011]SEQ ID No.2
[0012]重链:氨基酸序列(117AA)
[0013]Signal peptide
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FR1
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CDR1
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FR2
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CDR2
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FR3
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CDR3
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FR4
[0014]QVQLQQSGAELMRPGASVKISCKATGYTISSYWIEWVKQRPGHGLEWIGEILPGSGNTNYNEKFKGKATFTADTSSNTAYMQLSSLTSEDSAVYYC ARPRVYGLDYWGQGTSVTVSS
[0015]SEQ ID No.3
[0016]轻链:DNA序列(333bp)
[0017]Signal sequence
‑
FR1
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CDR1
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FR2
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CDR2
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FR3
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CDR3
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FR4
[0018]GACATTGTGCTGACCCAATCTCCAGCTTCTTTGGCTGTGTCTCTAGGGCAGAGGGCCACCATCTCCTGCAAGGCCAGCCAAAGTGTTGATTTTGAT GGTGATAGTTTTATGAACTGGTACCAACAGAAACCAGGACAGCCACCCAAACTCCTCATCTATGCTGCATCCAATCTAGAATCTGGGATCCCAGCC AGGTTTAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACCCTCAACATCCATCCTGTGGAGGAGGAGGATGCTGCAACCTATTACTGTCAGCAAAGTAAT GAGGATCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA
[0019]SEQ ID No.4
[0020]轻链:氨基酸序列(111AA)
[0021]Signal peptide
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FR1
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CDR1
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种抗甲型流感病毒血凝素蛋白单克隆抗体ZJU
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A1A3，该单克隆抗体亚型为IgG1、κ型，能与甲型流感H1N1和/或H3N2病毒血凝素蛋白抗原特异结合，抗体的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID No.2，轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。2.根据权利要求1所述的抗甲型流感病毒血凝素蛋白单克隆抗体ZJU
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A1A3，其特征在于：由杂交瘤细胞产生。3.根据权利要求2所述的抗甲型流感病毒血凝素蛋白单克隆抗体ZJU
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A1A3，其特征在于：产生该单克隆抗体的杂交瘤细胞是由免疫的BALB/C小鼠脾淋巴细胞和小鼠骨髓瘤细胞SP2/0经融合、筛选、克隆、传代和反复冻存、复苏后获得的杂交瘤细胞系ZJU
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A1A3，能稳定分泌抗甲型流感病毒血凝素蛋白的单克隆抗体ZJU
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A1A3。4.权利要求1所述的抗甲型流感H1N1和H3N2病毒血凝素蛋白的单克隆抗体ZJU
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A1A3的制备方法，其特征在于：该单克隆抗体通过的以下步骤获得：(1)小鼠免疫：选择6周龄的BALB/C小鼠，以纯化的H1N1和H3N2流感病毒的血凝素蛋白对小鼠进行序贯免疫；每只小鼠以30微克的H1N1抗原蛋白混合佐剂后大腿内侧肌肉注射免疫，第21天后再以30微克的H3N2抗原蛋白混合佐剂后大腿内侧肌肉注射免疫一次，共2次；第3次予H1N1抗原蛋白加强免疫，于3天后用于融合；(2)小鼠骨髓瘤细胞的培养：培养小鼠骨髓瘤细胞SP2/0并使其保持良好的生长状态用于杂交瘤细胞融合；(3)细胞融合：采用聚乙二醇细胞融合法；以BALB/C小鼠腹腔巨噬细胞作为饲养细胞，在融合前一天，接种BAL...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴海波，肖一鑫，杨帆，吴南屏，姚航平，黄灵童，
申请(专利权)人：浙江大学医学院附属第一医院，
类型：发明
国别省市：