一种专用于糖蛋白在线富集与分离的涂层柱及制备方法技术

本发明专利技术涉及涉及一种专用于糖蛋白在线富集与分离的苯硼酸

【技术实现步骤摘要】
一种专用于糖蛋白在线富集与分离的涂层柱及制备方法


[0001]本专利技术属于药物分析
，涉及一种毛细管电泳在线富集分离聚合物的涂层柱及制备方法，特别涉及一种专用于糖蛋白毛细管电泳在线富集与分离的苯硼酸
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聚甲基丙烯酸缩水甘油酯(以下简称PGMA)嵌段聚合物涂层柱及其制备方法。

技术介绍

[0002]蛋白质糖基化是最常见、最重要的蛋白质翻译后修饰之一，在生物体中有50％以上的蛋白质都存在糖基化现象。糖基化蛋白在许多生物学过程中发挥着关键作用，是一类重要的生物标识物。如糖基化蛋白质在病原对宿主的感染、癌症的发生和转移等生物过程中也起着重要的作用，这使其成为癌症预后和诊断的重要靶点。此外，在各种细胞阶段表达的糖蛋白的水平和类型的改变与许多人类疾病有关。因此，研究蛋白质的糖基化修饰及其在不同生理病理条件下的变化对疾病诊断有重要意义，而诊断结果的可靠性取决于对糖蛋白的分析技术和评估质量。
[0003]但是复杂生物样品中糖蛋白的丰度极低，在质谱检测中又容易受到其他高丰度非糖蛋白的干扰，因此预富集是糖蛋白分析的关键步骤。糖蛋白的检测往往分两步完成：首先，采用硼酸衍生物为亲和配体，通过直接化学键合法将其修饰在磁性纳米粒子或树枝状聚合物等材料表面，完成糖蛋白的离线预富集。离线富集需要对目标分析物进行过滤、萃取、吸附等前处理，试剂消耗量大、操作过程繁琐。在线富集技术则通过调节目标分析物所处状态及仪器参数即可实现分析物的高倍富集，具有操作简便、价格低廉等优点。其次，富集后的糖蛋白再使用色谱法和质谱法等进行分析检测。
[0004]毛细管电泳(CE)因引其分析速度快、分离效率高、样品消耗量少、高度自动化等特点，在超微量样品如蛋白质的定性定量分析中有广泛应用，已经成为蛋白分离分析的常规手段。目前，常用的CE在线富集技术主要包括样品堆积、动态pH界面、吹扫、瞬间等速电泳等，此外，利用具有刺激响应性混合物刷涂层毛细管实现蛋白质的在线富集是提高检测灵敏度的一种新思路。但是，由于毛细管在pH>3的情况下毛细管壁带负电，使得毛细管电泳法在蛋白质分离中吸附现象严重。为了减小CE对蛋白质的吸附问题，研究者们进行深入探索并提出了一些解决办法。对毛细管柱进行涂层修饰是最常见的抗蛋白质吸附方法。如何将硼亲和法对糖蛋白的选择性富集与CE法的高效分离性能相结合，并且克服CE法存在的蛋白质吸附缺陷，成为CE法实现糖蛋白在线富集与分离同时进行的关键问题。
[0005]本专利技术所用的苯硼酸
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PGMA嵌段聚合物涂层柱，在解决CE法存在的蛋白质吸附缺陷的同时，可实现痕量糖蛋白的在线富集与分离，尚未见相关报道。

技术实现思路

[0006]针对上述现有技术状况，本专利技术的目的在于提供一种专用于糖蛋白在线富集与分离的苯硼酸
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PGMA嵌段聚合物涂层柱及制备方法。
[0007]现将本专利技术构思及技术解决方案叙述如下：
[0008]本专利技术的基本构思是，利用毛细管电泳分析速度快、分离效率高、样品消耗量少等特点，研究提供一种高效、灵敏的专用于糖蛋白富集和分离的涂层柱；本专利技术是通过表面引发原子转移自由基聚合反应(ATRP)，在毛细管内壁引入ATRP大分子引发剂，分别以甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)及3
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丙烯酰胺基苯硼酸(AAPBA)为单体，制备苯硼酸
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PGMA嵌段聚合物涂层柱。以此通过表面引发原子转移自由基聚合反应(ATRP)，在毛细管内壁引入ATRP大分子引发剂，分别以甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)及3
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丙烯酰胺基苯硼酸(AAPBA)为单体，制备苯硼酸
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PGMA嵌段聚合物涂层柱。，在pH 8的碱性环境中糖蛋白选择性地与硼酸基团结合形成硼酸酯而被吸附，当pH 3时，硼酸酯发生解离而释放糖蛋白，再通过电泳法完成分离，此时PGMA层起到抑制蛋白吸附的作用，从而实现毛细管电泳法对糖蛋白的在线富集与分离。通过ATRP反应可将苯硼酸
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PGMA嵌段聚合物成功地修饰在毛细管内壁，此涂层柱具备pH响应功能，通过毛细管电泳在线富集方法可选择性地对糖蛋白进行富集，提高糖蛋白的检测信号，实现了糖蛋白的在线富集与分离。
[0009]本专利技术一种专用于糖蛋白在线富集与分离的涂层柱，其特征在于：所述的涂层柱采用内径50
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100μm、长度40
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100cm的熔融石英毛细管柱；所述熔融石英毛细管柱内壁具两层嵌段聚合物涂层，靠近毛细管柱内壁的内层是利用表面引发原子转移自由基聚合技术(ATRP技术)制备聚甲基丙烯酸缩水甘油酯(PGMA)涂层，外层是以
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Br溴原子为ATRP引发剂，以3
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丙烯酰胺基苯硼酸(AAPBA)作为反应单体的AAPBA涂层，构成苯硼酸
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聚甲基丙烯酸缩水甘油酯嵌段聚合物涂层毛细管柱涂层柱(简称苯硼酸
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PGMA)。
[0010]本专利技术提供一种专用于糖蛋白在线富集与分离的涂层柱的制备方法，其特征在于：通过表面引发原子转移自由基聚合反应(ATRP)，在毛细管内壁引入ATRP大分子引发剂，制备苯硼酸
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PGMA嵌段聚合物涂层柱；所述的涂层柱是由步骤1～步骤14的制备过程制备而成，步骤过程具体如下：
[0011]步骤1：检测前配制异硫氰酸荧光素(FITC)丙酮液、卵清蛋白溶液、牛血清蛋白溶液(BSA)、IgG溶液、IgG
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FITC混合液、磷酸缓冲溶液(PBS)；
[0012]步骤2：毛细管柱的活化；
[0013]步骤3：毛细管柱的3
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氨丙基三甲氧基硅烷(APTES)衍生；
[0014]步骤4：毛细管柱表面引发原子转移自由基聚合反应(ATRP)引发剂的制备；
[0015]步骤5：聚甲基丙烯酸缩水甘油酯(PGMA)涂层柱的制备；
[0016]步骤6：苯硼酸
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PGMA嵌段聚合物涂层柱的制备；
[0017]步骤7：毛细管外壁涂层的制备；
[0018]步骤8：红外光谱(FI
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IR)表征；
[0019]步骤9：倒置荧光显微表征；
[0020]步骤10：扫描电镜表征；
[0021]步骤11：毛细管电泳法对糖蛋白的在线富集与分离实验；
[0022]步骤12：涂层稳定性评价；
[0023]步骤13：对不同浓度IgG的富集情况；
[0024]步骤14：苯硼酸
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PGMA涂层柱在线富集鸡蛋清中的糖蛋白。
[0025]本专利技术进一步提供一种专用于糖蛋白在线富集与分离的涂层柱的制备方法，其特征在于步骤4中所述的“毛细管柱ATRP引发剂的制备”具体如下：
[0026]在烧瓶中，用二氯甲烷稀释2
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溴异丁酰溴，抽真空，充N2，反复三次，将烧瓶中的反应液泵入上述APTES衍生的毛细本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种专用于糖蛋白在线富集与分离的涂层柱，其特征在于：所述的涂层柱采用内径50
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100μm、长度40
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100cm的熔融石英毛细管柱；所述熔融石英毛细管柱内壁具两层嵌段聚合物涂层，靠毛细管柱内壁的内层是利用表面引发原子转移自由基聚合技术(ATRP技术)制备聚甲基丙烯酸缩水甘油酯(PGMA)涂层，外层是以
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Br溴原子为ATRP引发剂，以3
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丙烯酰胺基苯硼酸(AAPBA)作为反应单体的AAPBA涂层，构成苯硼酸
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聚甲基丙烯酸缩水甘油酯嵌段聚合物涂层毛细管柱涂层柱(以下简称苯硼酸
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PGMA)。2.一种专用于糖蛋白在线富集与分离的涂层柱的制备方法，其特征在于：通过表面引发原子转移自由基聚合反应(ATRP)，在毛细管内壁引入ATRP大分子引发剂，制备苯硼酸
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PGMA嵌段聚合物涂层柱；所述的涂层柱是由步骤1～步骤14的制备过程制备而成，具体如下：步骤1：检测前配制异硫氰酸荧光素(FITC)丙酮液、卵清蛋白溶液、牛血清蛋白溶液(BSA)、IgG溶液、IgG
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FITC混合液、磷酸缓冲溶液(PBS)；步骤2：毛细管柱的活化；步骤3：毛细管柱的3
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氨丙基三甲氧基硅烷(APTES)衍生；步骤4：毛细管柱表面引发原子转移自由基聚合反应(ATRP)引发剂的制备；步骤5：聚甲基丙烯酸缩水甘油酯(PGMA)涂层柱的制备；步骤6：苯硼酸
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PGMA嵌段聚合物涂层柱的制备；步骤7：毛细管外壁涂层的制备；步骤8：红外光谱(FI
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IR)表征；步骤9：倒置荧光显微表征；步骤10：扫描电镜表征；步骤11：毛细管电泳法对糖蛋白的在线富集与分离实验；步骤12：涂层稳定性评价；步骤13：对不同浓度IgG的富集情况；步骤14：苯硼酸
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PGMA涂层柱在线富集鸡蛋清...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘春叶，张剑，李文静，梁玲玲，苗延青，
申请(专利权)人：西安医学院，
类型：发明
国别省市：