一种用于体内产生CAR-M的脂质纳米颗粒及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种用于体内产生CAR

【技术实现步骤摘要】
一种用于体内产生CAR
‑
M的脂质纳米颗粒及其制备方法和应用


[0001]本专利技术属于生物医药领域，具体涉及一种用于体内产生CAR
‑
M的脂质纳米颗粒及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]近年来，细胞免疫疗法发展迅速，发展最快的为嵌合抗原受体T细胞(CAR
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T)疗法，从2017年至今已有4款CAR
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T疗法获得FDA批准上市。CAR
‑
T疗法的成功激发科学家们开展了对其他免疫细胞的基因工程改造研究。例如基于巨噬细胞能够浸润到实体瘤中的先天能力及其能够激活适应性免疫系统的能力，美国宾州大学研究者利用基因工程的方法将巨噬细胞改造成为嵌合抗原受体
‑
巨噬细胞(CAR
‑
M)，对实体瘤表现出了优异的治疗效果。该研发团队开发的HER2 CAR
‑
M进展迅速，目前已进入I期临床试验。
[0003]虽然CAR
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M疗法在治疗实体瘤上取得了这样令人鼓舞的成绩，但其临床应用仍面临如下三个技术瓶颈。首先，CAR
‑
M的获得和CAR
‑
T细胞的制备相似，也需要复杂的体外制备过程。目前CAR
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M的制备需要用腺病毒载体将CAR基因转导入巨噬细胞，接着是体外培养扩增、质量控制、包装运输，最后把CAR
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M细胞回输到病人体内。这一系列的操作过程带来了高昂的成本和高技术壁垒。第二，巨噬细胞在体内、外都几乎是不增殖的。一个病人一次能获得的巨噬细胞数量很有限，这会严重限制其治疗效果，若想达到治疗效果需多次制备CAR
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M细胞并反复输注，进一步增加了治疗成本。第三，由于腺病毒载体抗原性极强，作为异己抗原容易引发机体的特异性免疫反应，促使B细胞产生针对腺病毒载体的各种中和抗体，这使得腺病毒载体转导的细胞反复输注成为了困难。

技术实现思路

[0004]为解决针对CAR
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M疗法中体外制备存在的生产工艺复杂、周期长、质量控制要求严苛、成本高等一系列问题，本专利技术提出通过构建一种脂质纳米颗粒(LNP)包载CAR基因质粒，进入荷瘤动物体内后被巨噬细胞摄取，进行巨噬细胞的体内直接编程，使其表面表达CAR靶向杀伤肿瘤细胞，达到治疗实体瘤的目的。
[0005]本专利技术通过制备一种用于体内产生CAR
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M的脂质纳米颗粒使得CAR
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M的最终合成在体内完成，从而避免了上述一系列问题。脂质纳米颗粒的组成成分的合理化设计是本专利技术能够成功的关键。本专利技术制备的包载靶蛋白(如Trop)
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CAR基因质粒的LNP，需要完成被巨噬细胞摄取、在巨噬细胞内从溶酶体中逃逸、质粒DNA有效进入细胞核、质粒DNA稳定转染巨噬细胞等一系列过程，才能实现巨噬细胞表面CAR分子的表达。本专利技术制备过程中克服以下技术难点：1.为实现脂质纳米粒从内涵体逃逸，本专利技术需筛选各脂质DlinMC3、DOPE、Chol、PEG
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DMG、DOTAP和DSPE
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MTAS
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NLS的配比；2.为了将脂质纳米粒靶向运送到细胞核，本专利技术添加核定位肽；3.为了使LNP的整体电荷维持在中性，本专利技术增加DOTAP脂质。
[0006]本专利技术提供了一种用于体内产生CAR
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M的脂质纳米颗粒，包含脂质膜和由所述脂
质膜包裹的带有CAR的质粒；所述脂质膜包含DlinMC3、DOPE、Chol、PEG
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DMG、DOTAP和DSPE
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MTAS
‑
NLS等。
[0007]在一些实施方案中，本专利技术所述脂质膜中DlinMC3、DOPE、Chol、PEG
‑
DMG、DOTAP和DSPE
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MTAS
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NLS的摩尔比为(20
‑
50)：(5
‑
15)：(20
‑
45)：(1
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2)：(10
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20)：2。
[0008]在另一个实施方案中，所述脂质膜中DlinMC3、DOPE、Chol、PEG
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DMG、DOTAP和DSPE
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MTAS
‑
NLS的摩尔比为(30
‑
50)：10：(30
‑
38)：(1
‑
2)：(15
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20)：2。
[0009]在另一个实施方案中，所述脂质膜中DlinMC3、DOPE、Chol、PEG
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DMG、DOTAP和DSPE
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MTAS
‑
NLS的摩尔比为(30
‑
35)：(10
‑
15)：(20
‑
38)：(1.5
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2)：(10
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15)：2。
[0010]在一些实施方案中，所述带有CAR的质粒包含CD8 leader、抗靶蛋白的抗体相关区域、CD8 Hinge&TM、共刺激分子、CD3ζ；其中，所述抗靶蛋白的抗体相关区域选自全抗体、抗体的F(ab)2段、scFv等中的一种或多种；所述共刺激分子选自CD28、4
‑
1BB、OX40等中的一种或多种。
[0011]在一些实施方案中，所述带有CAR的质粒的CAR的靶蛋白选自Trop2、Her2、GPC3、Claudin 18.2、MSLN、EGFR等中的一种或者多种。
[0012]在一些实施方案中，所述靶蛋白为Trop2；所述带有CAR的质粒的核酸序列如SEQ ID NO.1所示。进一步地，抗靶蛋白的抗体相关区域为Trop2 scfv。所述Trop2 scfv的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0013]在一些实施方案中，所述脂质纳米颗粒还包含乙酸钠溶液；所述带有CAR的质粒为溶质溶于所述乙酸钠溶液。
[0014]本专利技术还提供了一种如上所述的用于体内产生CAR
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M的脂质纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：
[0015]S1、构建所述带有CAR的质粒；
[0016]S2、合成DSPE
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MTAS
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NLS；
[0017]S3、制备脂质体悬液：称取DlinMC3、DOPE、Chol、PEG
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DMG、DOTAP、DSPE
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MTAS
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NLS作为溶质溶于第一溶剂作为油相溶液，用蒸发仪除去第一溶剂，得到脂质膜；以第二溶剂作为水相溶剂，溶解所述步骤S1得到的带有CAR的质粒作为水相溶液，使得所述带有CAR的质粒与所述油相溶液的溶质的质量比为1:(10
‑
20)；在本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于体内产生CAR
‑
M的脂质纳米颗粒，其特征在于，包含脂质膜和由所述脂质膜包裹的带有CAR的质粒；所述脂质膜包含DlinMC3、DOPE、Chol、PEG
‑
DMG、DOTAP和DSPE
‑
MTAS
‑
NLS。2.如权利要求1所述的用于体内产生CAR
‑
T的脂质纳米颗粒，其特征在于，所述脂质膜中DlinMC3、DOPE、Chol、PEG
‑
DMG、DOTAP和DSPE
‑
MTAS
‑
NLS的摩尔比为(20
‑
50)：(5
‑
15)：(20
‑
45)：(1
‑
2)：(10
‑
20)：2。3.如权利要求1所述的用于体内产生CAR
‑
T的脂质纳米颗粒，其特征在于，所述脂质膜中DlinMC3、DOPE、Chol、PEG
‑
DMG、DOTAP和DSPE
‑
MTAS
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NLS的摩尔比为(30
‑
50)：10：(30
‑
38)：(1
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2)：(15
‑
20)：2。4.如权利要求1所述的用于体内产生CAR
‑
T的脂质纳米颗粒，其特征在于，所述脂质膜中DlinMC3、DOPE、Chol、PEG
‑
DMG、DOTAP和DSPE
‑
MTAS
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NLS的摩尔比为(30
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35)：(10
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15)：(20
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38)：(1.5
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2)：(10
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15)：2。5.如权利要求1所述的用于体内产生CAR
‑
M的脂质纳米颗粒，其特征在于，所述带有CAR的质粒包含CD8 leader、抗靶蛋白的抗体相关区域、CD8 Hinge&TM、共刺激分子、CD3ζ；其中，所述抗靶蛋白的抗体相关区域选自全抗体、抗体的F(ab)2段、scFv中的一种或多种；所述共刺激分子选自CD28、4
‑
1BB、OX40中的一种或多种。6.如权利要求1所述的用于体内产生CAR
‑
M的脂质纳米颗粒，其特征在于，所述带有CAR的...

【专利技术属性】
技术研发人员：闫志强，周靖娥，王哲豪，孙磊，王镜，俞磊，
申请(专利权)人：华东师范大学，
类型：发明
国别省市：