测序和高分辨率成像制造技术

本文公开了用于检测和辨别来自密集封装的基底的光学信号的方法和系统。这些方法和系统广泛应用于接近或低于光学系统的衍射极限的生物分子检测，包括应用于改善多核苷酸测序应用的效率和准确度。应用的效率和准确度。应用的效率和准确度。

【技术实现步骤摘要】
测序和高分辨率成像
本申请是申请日为2018年03月19日、申请号为201880032918.0、专利技术名称为“测序和高分辨率成像”的中国专利申请(其对应PCT申请的申请日为2018年03月19日、申请号为PCT/US2018/023187)的分案申请。相关申请的交叉引用
[0001]该申请要求于2017年3月17号提交的美国临时申请号62/473,163的权益，该临时申请的整体公开内容通过引用而全文并入于此用于所有目的。

技术介绍

[0002]降低测序成本对于实现医疗保健改善至关重要。衡量测序成本的标准是30X人类基因组(被定义为90千兆碱基对)的价格。
[0003]基因组的价格从2007年至2011年大幅度下降，那之后价格稳定在每个基因组略低于10,000美元。近期所实现的每个基因组1,000美元成为重要的里程碑。下一个重要的里程碑为每个基因组100美元，这预计将花费数年的时间。本专利技术讨论了在实质上缩短的时间范围内实现每个基因组10美元的方法。在这个价格点上，对每个新生儿进行测序将是经济的，并且将显著降低疾病诊断和筛查——尤其是在肿瘤学领域的成本障碍。
[0004]测序系统的主要成本构成主要是耗材，其中包括生物芯片和试剂，其次是仪器成本。
[0005]为了实现10美元30X基因组，即成本降低100倍，则需要将每单位面积的数据量增加100倍，并且需要将每个数据点的试剂量减少100倍。
[0006]在一个簇密度为每平方厘米一千万个分子的1,000美元基因组平台的实例中，每个分子平均占据10um2的芯片面积。因此，平均有效间距为3,160nm。如果少用100倍的拷贝能够获得高100倍的密度，则对于相同的芯片面积和试剂，将获得多100倍的信息，从而使成本降低100倍。如果密度高100倍，则新的间距需为320nm。用于平衡试剂使用的拷贝数为10个拷贝/分子，比1,000个拷贝/簇少了100倍。
[0007]因此，需要一种可以分辨间距为约320nm的单分子的光学信号的光学成像系统。但是，由于由λ/(2*N.A.)定义的光的衍射极限，要实现该分辨率具有挑战性，其中λ是光的波长，而N.A.是光学成像系统的数值孔径，其在基于水的体系(如用于测序和分析物检测的体系)中接近1。因此，对于检测在650nm附近发射的光学信号而言，320nm的间隔接近或低于衍射极限，这可能会妨碍对该类阵列上的各个特征的分辨。
[0008]尽管存在不受光学信号的衍射极限所限制的其他方法，如由诸如Ion Torrent(由Thermo Fisher收购)和Oxford Nanopore等公司开发的基于电气的系统，但是目前基于图像的测序系统在所有现有的测序技术中具有最低的测序成本。基于图像的系统通过高通量成像光学元件与低成本耗材的组合而实现低成本。
[0009]因此，所需要的是克服衍射极限以便于提高对紧密封装的基底上的各个特征的分辨率的光学成像方法和系统，从而可以高准确度地实现低于衍射极限的分辨率。这些方法和系统可以具体应用于高分辨率特征检测中，包括用于多核苷酸序列检测的光学成像。

技术实现思路

[0010]用于对固定至基底表面的单分子分析物进行亚衍射极限成像的方法和系统。基底包括用于与分析物进行结合反应的流动池等。分析物包括在表面上用于单分子分辨的离散位置处间隔开的生物分子，如个体多核苷酸或蛋白质。这些方法和系统可以用于诸如单分子合成测序等应用中的高分辨率单分子检测。
[0011]在一些实施方案中，本文提供了一种用于以单分子分辨率对以高密度固定在基底表面上的多个多核苷酸进行测序的方法，其包括：提供包含表面的基底，其中所述表面包含在离散位置处固定在所述表面上的多个多核苷酸，并且其中所述表面包含用于合成测序的试剂；进行多个循环的单分子合成测序，每个循环包括：使所述多核苷酸与一组包含可检测标记的可逆终止子核苷酸接触；用光学系统对所述表面的场进行成像，以检测来自掺入所述多核苷酸中的每个核苷酸的光学信号，从而检测所述循环的所述场中的多个光学信号；根据来自所述多个循环中的至少两个循环的所述场的图像的所述多个光学信号中的每一个光学信号来确定峰位置；将每个光学信号的所述峰位置叠加，并将光学分布模型应用到每个光学信号簇，从而以改善的准确度来确定所述表面上的每个检测的分析物的相对位置；使用所述确定的相对位置和去卷积函数，对来自每个循环的每个场图像中的所述光学信号进行去卷积；根据所述去卷积的光学信号来识别每个场和每个循环中掺入所述多核苷酸中的所述可检测标记；以及在每个多核苷酸位置处根据所述多个循环中的所述识别的可检测标记对固定在所述基底表面上的所述多个多核苷酸进行测序。
[0012]在一些实施方案中，所述基底包含1,000个或更少、500个或更少、100个或更少、50个或更少、25个或更少、20个或更少、15个或更少或者10个或更少的包含相同序列的单分子的克隆拷贝。在一些实施方案中，所述多核苷酸为DNA多联体。
[0013]在一些实施方案中，每个循环还包括在使所述表面与所述多个可逆终止子核苷酸接触之后并且在对所述场进行成像之前，洗涤所述表面以去除未结合的核苷酸。在一些实施方案中，如果将进行另一循环，则所述循环还包括切割所述可逆终止子。在一些实施方案中，如果将进行另一循环，则所述循环还包括切割所述可检测标记。
[0014]在一些实施方案中，所述可逆终止子核苷酸组包含至少两种不同的核苷酸，每种核苷酸具有不同的可检测标记。在一些实施方案中，所述可逆终止子核苷酸组包含至少四种不同的核苷酸，每种核苷酸具有不同的可检测标记。在一些实施方案中，所诉可逆终止子核苷酸组包含腺嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和鸟嘌呤。在一些实施方案中，所述可逆终止子核苷酸组包含腺嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶和鸟嘌呤。
[0015]在一些实施方案中，所述多核苷酸包括脱氧核糖核酸或核糖核酸。在一些实施方案中，所述多个靶多核苷酸的长度为约1kb至约100kb。在一些实施方案中，所述多个靶多核苷酸的长度为约10kb至约50kb。在一些实施方案中，与所述表面结合的多核苷酸相隔至少10nm的距离。
[0016]在一些实施方案中，所述可检测标记与所述可逆终止子核苷酸的3'
‑
OH基团结合。在一些实施方案中，并非是可检测标记的封闭基团与所述可逆终止子核苷酸的3
’‑
OH结合。
[0017]在一些实施方案中，所述多个靶多核苷酸通过在离散位置与结合至所述表面的捕获探针进行结合而固定。在一些实施方案中，所述多个靶多核苷酸与衔接子连接，所述衔接子包含与所述捕获探针的序列互补的捕获序列和与所述测序引物的序列互补的引发序列。
在一些实施方案中，所述捕获序列为20至50mer。在一些实施方案中，所述引发序列为20至50mer。
[0018]在一些实施方案中，所述测序方法还包括通过比较一组具有相同序列的多核苷酸或者基于数据本身来进行先前循环回归以校正相位误差。
[0019]在一些实施方案中，所述去卷积包括使用来自所述确定的相本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于对以高密度固定在基底表面上的多个多核苷酸进行测序的方法，其包括：a.提供包含表面的基底，其中所述表面包含在离散位置处固定在所述表面上的多个多核苷酸，并且其中所述表面包含用于合成测序的试剂；b.进行多个循环的单分子合成测序，每个循环包括：i.使所述多核苷酸与一组包含可检测标记的可逆终止子核苷酸接触；ii.用光学系统对所述表面的场进行成像，以检测来自掺入所述多核苷酸中的每个核苷酸的光学信号，从而检测所述循环的所述场中的多个光学信号；c.根据来自所述多个循环中的至少两个循环的所述场的图像的所述多个光学信号中的每一个光学信号来确定峰位置；d.将每个光学信号的所述峰位置叠加，并将光学分布模型应用到每个光学信号簇，从而以改善的准确度来确定所述表面上的每个检测的掺入核苷酸的相对位置；e.使用所述确定的相对位置和去卷积函数，对来自每个循环的每个场图像中的所述光学信号进行去卷积；f.根据所述去卷积的光学信号来识别每个场和每个循环中的掺入所述多核苷酸中的所述可检测标记；以及g.在每个多核苷酸位置处根据所述多个循环中的所述识别的可检测标记对固定在所述基底表面上的所述多个多核苷酸进行测序。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述基底包含1,000个或更少、500个或更少、100个或更少、50个或更少、25个或更少、20个或更少、15个或更少或者10个或更少的包含相同序列的多核苷酸的克隆拷贝。3.根据权利要求1所述的方法，其中所述多核苷酸为DNA多联体。4.根据权利要求1所述的方法，其中每个循环还包括在使所述表面与所述多个可逆终止子核苷酸接触之后并且在对所述场进行成像之前，洗涤所述表面以去除未结合的核苷酸。5.根据权利要求1所述的方法，其中如果将进行另一循环，则所述循环还包括切割所述可逆终止子。6.根据权利要求1所述的方法，其中如果将进行另一循环，则所述循环还包括切割所述可检测标记。7.根据权利要求1所述的方法，其中所述可逆终止子核苷酸组包含至少两种不同的核苷酸，每种核苷酸具有不同的可检测标记。8.一种用于准确地确定固定在密集封装的基底的表面上的分析物的相对位置的方法，其包括：a.提供包含表面的基底，其中所述表面包含在离散位置处固定在所述表面上的多个分析物；b.在所述表面上进行多个循环的探针结合和信号检测，每个循环包括：i.使所述分析物与来自探针组...

【专利技术属性】
技术研发人员：B，
申请(专利权)人：雅普顿生物系统公司，
类型：发明
国别省市：