用于预防和治疗EB病毒感染及相关疾病的表位肽及抗体制造技术

本发明专利技术涉及免疫学领域和分子病毒学领域，特别是EBV的预防和治疗领域。具体而言，本发明专利技术涉及可用于预防或治疗EBV感染的表位肽(或其变体)，包含此类表位肽(或其变体)以及载体蛋白的重组蛋白，以及此类表位肽(或其变体)和重组蛋白的用途。本发明专利技术还涉及针对此类表位肽的抗体，及其用于检测、预防和/或治疗EBV感染和/或由所述感染引起的疾病的用途。或由所述感染引起的疾病的用途。或由所述感染引起的疾病的用途。

【技术实现步骤摘要】
用于预防和治疗EB病毒感染及相关疾病的表位肽及抗体


[0001]本专利技术涉及免疫学领域和分子病毒学领域，特别是EBV的预防和治疗领域。具体而言，本专利技术涉及可用于预防或治疗EBV感染的表位肽(或其变体)，包含此类表位肽(或其变体)以及载体蛋白的重组蛋白，以及此类表位肽(或其变体)和重组蛋白的用途。本专利技术还涉及针对此类表位肽的抗体，及其用于检测、预防和/或治疗EBV感染和/或由所述感染引起的疾病的用途。

技术介绍

[0002]EB病毒(Epstein
‑
Barr virus，EBV)是γ疱疹病毒亚科的成员之一，与免疫受损宿主中的淋巴增殖性疾病(LPD)相关，并与多种不同类型的人类B细胞和上皮细胞恶性肿瘤相关。在免疫功能健全人群中，大多数EB病毒感染者无临床症状或仅有亚临床表现，但在免疫功能低下的感染者中则可能有着较高的发病率和死亡率。目前对于EBV提供的治疗方法非常有限，主要采用CD20单克隆抗体治疗或化学药物治疗，然而CD20单克隆抗体治疗不仅可杀死EBV感染的B细胞，同时也会导致正常B淋巴细胞死亡，令患者免疫功能进一步下降。常规化学药物治疗可导致患者整体免疫功能下降并引起其他的严重毒副作用。
[0003]因此，针对EBV发展创新的、更为有效的治疗EBV感染的方法和药物是迫切而必要的。

技术实现思路

[0004]尽管EB病毒的各种蛋白上可能存在多个B细胞应答(抗体应答)表位，然而并非针对任意表位的抗体都能应用于EBV感染的治疗。因此，发展能有效地治疗EBV感染的免疫治疗药物/方法的关键在于，鉴定能诱发有效清除体内病毒和被病毒感染的细胞的抗体应答的靶标(表位)，以及获得针对该靶标(表位)的抗体。
[0005]本专利技术鉴定了此类靶标(表位)，并基于此提供了可用于治疗EBV感染的表位肽(或其变体)，包含此类表位肽(或其变体)和载体蛋白的重组蛋白，以及此类表位肽(或其变体)和重组蛋白的用途。本专利技术还提供了针对此类表位肽/表位的具备优良性质的单克隆抗体，其能够高效中和EBV，阻断或抑制EBV与细胞融合。由此本专利技术提供了以下方面。
[0006]单抗3A3的识别表位肽及其衍生抗体
[0007]表位肽
[0008]在第一方面，本专利技术提供了一种分离的表位肽或其变体，所述表位肽包含位于EBV gB蛋白的第341
‑
362位氨基酸残基内的表位，所述表位至少包含EBV gB蛋白的第352位、第356位和第360位氨基酸残基；
[0009]所述变体与其所源自的表位肽相异仅在于1个或几个(例如1个，2个或3个)氨基酸残基的突变(例如置换、添加或缺失)，并且在对应于EBV gB蛋白的氨基酸位置352、356和360的位置中不包含突变，并且保留了其所源自的表位肽的生物学功能。
[0010]本专利技术第一方面所述的表位肽的生物学功能包括但不限于选自下列的一种或多
种：
[0011]1)与单克隆抗体3A3(例如具有如SEQ ID NOs:3
‑
5所示的重链CDRs和SEQ ID NOs:6
‑
8所示的轻链CDRs)的特异性结合；
[0012]2)在受试者体内诱导能中和EBV、和/或阻断或抑制EBV与细胞融合的抗血清的能力(任选地，在将所述表位肽与载体蛋白融合后)；
[0013]3)诱发有效清除体内的EBV和被EBV感染的细胞的抗体应答的能力(任选地，在将所述表位肽与载体蛋白融合后)；和
[0014]4)预防和/或治疗受试者的EBV感染或与EBV感染相关的疾病的能力(任选地，在将所述表位肽与载体蛋白融合后)。
[0015]在某些实施方案中，所述EBV是M81毒株(例如Genbank ID：KF373730.1)。在某些实施方案中，所述EBV gB蛋白具有如SEQ ID NO:17所示的序列。
[0016]在某些实施方案中，所述EBV gB蛋白的第341
‑
362位氨基酸残基如SEQ ID NO:18所示。
[0017]在某些实施方案中，所述表位是线性表位，其由位于EBV gB蛋白的第341
‑
362位氨基酸残基内的至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少15个或至少20个连续氨基酸残基组成。
[0018]在某些实施方案中，所述线性表位由EBV gB蛋白的第341
‑
362位氨基酸残基组成。
[0019]在某些实施方案中，所述表位肽由EBV gB蛋白的5
‑
50个(例如10
‑
50个，10
‑
40个，20
‑
40个；例如20
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25个或35
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40个；例如20个，21个，22个，23个，24个，25个，26个，27个，28个，30个，31个，32个，33个，34个，35个，36个，37个，38个，39个，或40个)连续氨基酸残基组成，并且包含所述线性表位。
[0020]在某些实施方案中，所述表位肽由EBV gB蛋白的第341
‑
362位氨基酸残基或第331
‑
367位氨基酸残基组成。
[0021]在某些实施方案中，所述表位肽由SEQ ID NO:18或19所示的序列组成。
[0022]在某些实施方案中，所述表位是构象表位，其由位于EBV gB蛋白的第341
‑
362位氨基酸残基内的至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少15个或至少20个非连续氨基酸残基组成，并且至少包含EBV gB蛋白的第352位、第356位和第360位氨基酸残基。
[0023]在某些实施方案中，所述表位肽由EBV gB蛋白的5
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50个(例如10
‑
50个，10
‑
40个，20
‑
40个；例如20
‑
25个或35
‑
40个；例如20个，21个，22个，23个，24个，25个，26个，27个，28个，30个，31个，32个，33个，34个，35个，36个，37个，38个，39个，或40个)连续氨基酸残基组成，并且包含所述构象表位。
[0024]特别地，可以将本专利技术的表位肽或其变体与载体蛋白融合，以增强表位肽或其变体的免疫原性，使得表位肽或其变体能够被机体的免疫系统识别，并诱发有效清除体内病毒和被病毒感染的细胞的抗体应答。
[0025]因此，在第二方面，本专利技术还提供了一种重组蛋白，其包含第一方面所述的分离的表位肽或其变体，以及载体蛋白，并且所述重组蛋白不是天然存在的蛋白或其片段。在所述重组蛋白中，所述表位肽或其变体可以连接至载体蛋白的N末端或C末端，插入载体蛋白的内部，或替换载体蛋白的部分氨基酸序列，视所使用的具体载体蛋白而定。此外，任选地，所
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.抗体或其抗原结合片段，其特异性结合EBV gB蛋白的第341
‑
362位氨基酸残基内包含的表位，所述表位至少包含EBV gB蛋白的第352位、第356位和第360位氨基酸残基；优选地，所述表位是线性表位，其由位于EBV gB蛋白的第341
‑
362位氨基酸残基内的至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少15个或至少20个连续氨基酸残基组成；优选地，所述表位是构象表位，其由位于EBV gB蛋白的第341
‑
362位氨基酸残基内的至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少15个或至少20个非连续氨基酸残基组成，并且至少包含EBV gB蛋白的第352位、第356位和第360位氨基酸残基；优选地，所述表位由EBV gB蛋白的第341
‑
362位氨基酸残基组成。2.抗体或其抗原结合片段，其特异性结合EBV的gB蛋白，所述抗体或其抗原结合片段包含：(a)包含下述3个互补决定区(CDRs)的重链可变区(VH)：(i)VH CDR1，其由下述序列组成：SEQ ID NO:3，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列，(ii)VH CDR2，其由下述序列组成：SEQ ID NO:4，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列，和(iii)VH CDR3，其由下述序列组成：SEQ ID NO:5，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；和/或，(b)包含下述3个互补决定区(CDRs)的轻链可变区(VL)：(iv)VL CDR1，其由下述序列组成：SEQ ID NO:6，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列，(v)VL CDR2，其由下述序列组成：SEQ ID NO:7，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列，和(vi)VL CDR3，其由下述序列组成：SEQ ID NO:8，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；优选地，(i)
‑
(vi)任一项中所述的CDR根据IMGT编号系统定义；优选地，(i)
‑
(vi)任一项中所述的置换为保守置换。3.权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段，其包含：(a)如下3个重链CDRs：序列为SEQ ID NO：3的VH CDR1，序列为SEQ ID NO：4的VH CDR2，序列为SEQ ID NO：5的VH CDR3；和/或，如下3个轻链CDRs：序列为SEQ ID NO：6的VL CDR1，序列为SEQ ID NO：7的VL CDR2，序列为SEQ ID NO：8的VL CDR3；或，(b)如SEQ ID NO:1所示的重链可变区(VH)中含有的3个CDR；和/或，如SEQ ID NO:2所示的轻链可变区(VL)中含有的3个CDR；优选地，所述VH中含有的3个CDR和/或所述VL中含有的3个CDR由Kabat、IMGT或Chothia编号系统定义。4.权利要求1
‑
3任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其包含：(a)重链可变区(VH)，其包含选自下列的氨基酸序列：
(i)SEQ ID NO：1所示的序列；(ii)与SEQ ID NO：1所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；或(iii)与SEQ ID NO：1所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列；和(b)轻链可变区(VL)，其包含选自下列的氨基酸序列：(iv)SEQ ID NO：2所示的序列；(v)与SEQ ID NO：2所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；或(vi)与SEQ ID NO：2所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列；优选地，(ii)或(v)中所述的置换是保守置换；优选地，所述抗体或其抗原结合片段包含：包含如SEQ ID NO:1所示的序列的VH和包含如SEQ ID NO:2所示的序列的VL。5.抗体或其抗原结合片段，其特异性结合EBV gB蛋白的第528
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616位氨基酸残基内包含的表位，所述表位至少包含EBV gB蛋白的第540位、第567位、第610位和第613位氨基酸残基；优选地，所述表位是线性表位，其由位于EBV gB蛋白的第528
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616位氨基酸残基内的至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少15个或至少20个连续氨基酸残基组成；优选地，所述表位是构象表位，其由位于EBV gB蛋白的第528
‑
616位氨基酸残基内的至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少15个或至少20个非连续氨基酸残基组成，并且至少包含EBV gB蛋白的第540位、第567位、第610位和第613位氨基酸残基；优选地，所述表位由EBV gB蛋白的第528
‑
616位氨基酸残基组成。6.抗体或其抗原结合片段，其特异性结合EBV的gB蛋白，所述抗体或其抗原结合片段包含：(a)包含下述3个互补决定区(CDRs)的重链可变区(VH)：(i)VH CDR1，其由下述序列组成：SEQ ID NO:11，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列，(ii)VH CDR2，其由下述序列组成：SEQ ID NO:12，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列，和(iii)VH CDR3，其由下述序列组成：SEQ ID NO:13，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；和/或，(b)包含下述3个互补决定区(CDRs)的轻链可变区(VL)：
(iv)VL CDR1，其由下述序列组成：SEQ ID NO:14，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列，(v)VL CDR2，其由下述序列组成：SEQ ID NO:15，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列，和(vi)VL CDR3，其由下述序列组成：SEQ ID NO:16，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；优选地，(i)
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(vi)任一项中所述的CDR根据IMGT编号系统定义；优选地，(i)
‑
(vi)任一项中所述的置换为保守置换。7.权利要求5或6所述的抗体或其抗原结合片段，其包含：(a)如下3个重链CDRs：序列为SEQ ID NO：11的VH CDR1，序列为SEQ ID NO：12的VH CDR2，序列为SEQ ID NO：13的VH CDR3；和/或，如下3个轻链CDRs：序列为SEQ ID NO：14的VL CDR1，序列为SEQ ID NO：15的VL CDR2，序列为SEQ ID NO：16的VL CDR3；或，(b)如SEQ ID NO:9所示的重链可变区(VH)中含有的3个CDR；和/或，如SEQ ID NO:10所示的轻链可变区(VL)中含有的3个CDR；优选地，所述VH中含有的3个CDR和/或所述VL中含有的3个CDR由Kabat、IMGT或Chothia编号系统定义。8.权利要求5
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7任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其包含：(a)重链可变区(VH)，其包含选自下列的氨基酸序列：(i)SEQ ID NO：9所示的序列；(ii)与SEQ ID NO：9所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；或(iii)与SEQ ID NO：9所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列；和(b)轻链可变区(VL)，其包含选自下列的氨基酸序列：(iv)SEQ ID NO：10所示的序列；(v)与SEQ ID NO：10所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；或(vi)与SEQ ID NO：10所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列；优选地，(ii)或(v)中所述的置换是保守置换；优选地，所述抗体或其抗原结合片段包含：包含如SEQ ID NO:9所示的序列的VH和包含如SEQ ID NO:10所示的序列的VL。9.权利要求1
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8任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其是人源化的；优选地，所述抗体或其抗原结合片段包含来源于人免疫球蛋白的框架区序列；优选地，所述抗体或其抗原结合片段包含：来源于人重链胚系序列的重链框架区序列，以及来源于人轻链胚系序列的轻链框架区序列。
10.权利要求1
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9任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其进一步包含来源于兔或人免疫球蛋白的恒定区；优选地，所述抗体或其抗原结合片段的重链包含来源于人免疫球蛋白(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)的重链恒定区，所述抗体或其抗原结合片段的轻链包含来源于人免疫球蛋白(例如κ或λ)的轻链恒定区；优选地，所述抗体或其抗原结合片段的重链包含如SEQ ID NO:30所示的重链恒定区，所述抗体或其抗原结合片段的轻链包含如SEQ ID NO:31所示的轻链恒定区。11.权利要求1
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10任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗原结合片段选自Fab、Fab
’
、(Fab
’
)2、Fv、二硫键连接的Fv、scFv、双抗体(diabody)和单域抗体(sdAb)；和/或，所述抗体为兔源抗体、嵌合抗体、人源化抗体、双特异性抗体或多特异性抗体。12.权利要求1
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11任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段具备以下特征中的一项或多项：(a)在体外或受试者(例如人)体内中和EBV；(b)在体外或受试者(例如人)体内中阻断或抑制EBV与细胞融合；(c)预防和/或治疗EBV感染或与EBV感染相关的疾病。13.分离的核酸分子，其编码权利要求1
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12任一项所述的抗体或其抗原结合片段，或其重链可变区和/或轻链可变区。14.载体，其包含权利要求13所述的核酸分子；优选地，所述载体为克隆载体或表达载体。15.宿主细胞，其包含权利要求13所述的核酸分子或权利要求14所述的载体。16.制备权利要求1
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12任一项所述的抗体或其抗原结合片段的方法，其包括，在允许所述抗体或其抗原结合片段表达的条件下，培养权利要求15所述的宿主细胞，和从培养的宿主细胞培养物中回收所述抗体或其抗原结合片段。17.组合物，其包含：(i)权利要求1
‑
4任一项的抗体或其抗原结合片段，或者，编码权利要求1
‑
4任一项的抗体或其抗原结合片段的核酸分子、载体或宿主细胞；以及，(ii)权利5
‑
8任一项的抗体或其抗原结合片段，或者，编码权利要求5
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8任一项的抗体或其抗原结合片段的核酸分子、载体或宿主细胞；优选地，所述组合物包含权利要求1
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4任一项的抗体或其抗原结合片段，以及，权利5
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8任一项的抗体或其抗原结合片段；优选地，(i)中所述抗体为嵌合抗体，和/或,，(ii)中所述抗体为嵌合抗体。18.药物组合物，其包含权利要求1
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12任一项所述的抗体或其抗原结合片段或权利要求17的组合物，以及任选的药学上可接受的载体和/或赋形剂。19.权利要求1
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12任一项所述的抗体或其抗原结合片段、权利要求13的分离的核酸分子、权利要求14的载体、权利要求15的宿主细胞、权利要求17的组合物或权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈毅歆，张晓，洪俊平，徐淼，吴倩，钟玲，夏宁邵，曾益新，
申请(专利权)人：中山大学肿瘤防治中心中山大学附属肿瘤医院，中山大学肿瘤研究所中山大学，
类型：发明
国别省市：