大队列样本单细胞富集和混样建库测序方法技术

本发明专利技术公开一种大队列样品单细胞富集和混样建库测序方法，包括如下步骤：S1、形成多来源的单细胞样品；S2、对不同来源的单细胞样品分别进行生物素抗体孵育、链霉亲和素偶联寡核苷酸标记，然后多样品混合形成混合样品；S3、制备3

【技术实现步骤摘要】
大队列样本单细胞富集和混样建库测序方法


[0001]本专利技术属于生物医学研究领域，具体涉及一种大队列样本单细胞富集、亲和素抗体孵育、链霉亲和素偶联寡核苷酸标记样品、单细胞转录组混样建库测序及分析的方法。

技术介绍

[0002]转录组测序(RNASequencing,RNA
‑
seq)是指对某一物种或特定细胞在某一功能状态下产生的mRNA进行高通量测序，既可以检测基因表达水平差异、提供定量分析，又可以提供结构分析，识别可变剪切位点、基因融合等，而且不依赖于参考基因组。传统转录组测序(BulkRNASequencing,BulkRNA
‑
seq)测量一个大的细胞群体中每一个基因的平均表达水平，对于基因表达的本质研究不够深入，很多基因表达的时空信息被掩盖、也不能反映组织细胞间的异质性(LiX,WangCY.Frombulk,single
‑
cellto spatial RNAsequencing[J].IntJOral Sci,2021,13(1):36)。
[0003]近年来，单细胞转本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种大队列样品单细胞富集和混样建库测序方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、自不同来源的血液或骨髓或瘤体组织样本中分离富集目的细胞，形成单细胞样品；S2、对步骤S1获得的多样本来源的单细胞样品进行生物素抗体孵育，并通过链霉亲和素偶联寡核苷酸标记各样品，然后将不同来源的样品混合形成混合样品；S3、将混合样品放入Chromium Controller中获得GEMs，再对GEMs进行逆转录反应，获得DNA溶液，然后在得到的DNA产物中加入PCR mix、转录组cDNA引物和标记DNA引物进行扩增反应，并通过琼脂糖凝胶电泳分离回收标记DNA样品和3
’
转录组cDNA样品；S4、利用3
’
转录组cDNA样品进行接头连接和文库测序索引PCR反应，构建3
’
转录组文库；S5、利用标记DNA样品进行文库测序索引PCR反应，构建标记DNA文库；S6、按照测序平台的要求对3
’
转录组文库和标记DNA文库进行变性和稀释，并对3
’
转录组文库和标记DNA文库合并进行测序。2.根据权利要求1所述的大队列样品单细胞富集和混样建库测序方法，其特征在于，在步骤S1完成后，对短期内不进行步骤S2处理的单细胞样品进行冻存，并在进行步骤S2前对样品进行复苏。3.根据权利要求2所述的大队列样品单细胞富集和混样建库测序方法，其特征在于，样品进行冻存的具体方法为：Ⅰ、提前在4℃条件下预冷细胞程序降温盒、冻存管和冻存液；Ⅱ、用细胞计数器确定单细胞样品的总细胞数和细胞活力；Ⅲ、将单细胞样品放入离心机，在4℃，400
×
g离心力下离心7min，去除上清液；Ⅳ、将单细胞样品保持在冰上，用培养液将细胞沉淀重悬，使细胞浓度为4
‑
20
×
106cells/mL；
Ⅴ
、加入等体积的预冷冻存液，使细胞浓度为2
‑
10
×
106cells/mL，并轻柔混匀；
Ⅵ
、将细胞悬液分装到预冷的冻存管中，并将冻存管放入预冷的细胞程序降温盒中；
Ⅶ
、将细胞程序降温盒置于
‑
80℃条件下4h以上，然后将冻存管转移到液氮中进行长期储存。4.根据权利要求2所述的大队列样品单细胞富集和混样建库测序方法，其特征在于，样品进行复苏的具体方法为：Ⅰ、取出装有单细胞样品的冻存管，并立即在37℃的水浴中解冻2
‑
3min，融化至仅残留微小冰晶时，从水浴中取出；在超净台中，用预温的完全生长培养基冲洗冻存管，并用移液管将解冻的单细胞样品转移到离心管中；Ⅱ、在摇动离心管的同时，按照1mL/3
‑
5s的速度将与管内单细胞样品同体积的培养基加入离心管中，循环稀释细胞共5次，两次添加之间等待1min；然后将离心管放入离心机中，在400
×
g离心力下离心7min，除去上清液，并使用移液管将细胞沉淀重悬；Ⅲ、向管内再次添加培养基，混匀细胞，计数确定细胞浓度，直至细胞浓度为1.8
‑
2.2
×
106/mL，将管内悬液转移到另外的离心管中，并在400
×
g离心力下再次离心7min，去除上清液，用宽口移液管向管内加入缓冲液PBS+并吹打混匀；Ⅳ、用缓冲液PBS+冲洗离心管，并将含有细胞的悬液转移到新的EP管中，在400
×
g离心力下离心7min，去除上清液；向EP管内添加缓冲液PBS+，以获得浓度为600
‑
1200cells/μL的
细胞悬液，用移液枪轻轻混合细胞悬液；
Ⅴ
、细胞悬液通过70μm Mesh，去除细胞团块获得单细胞悬液，单细胞悬液置于冰上，用于后续高通量单细胞转录组文库构建和测序。5.根据权利要求1所述的大队列样品单细胞富集和混样建库测序方法，其特征在于，步骤S1中单细胞样品为肿瘤组织TIL细胞、循环肿瘤细胞、血液或骨髓单个核细胞、血液或骨髓中的NK、NKT或Treg稀有细胞，其中一种富集形成。6.根据权利要求5所述的大队列样品单细胞富集和混样建库测序方法，其特征在于，步骤S1中单细胞样品为肿瘤组织TIL细胞时，单细胞样品的制备方法为：Ⅰ、切除新鲜瘤体组织，修剪去除坏死部分与结缔组织，用缓冲液PBS+冲洗干净，移至无菌平皿内，用手术剪将肿瘤组织剪碎至1
‑
2mm3小块，加入消化液混匀，转移至带有磁棒的无菌三角烧瓶内，37℃恒温的磁力搅拌器上搅拌1
‑
3h；用120μm Mesh过滤消化后的细胞悬液，以除去未消化好的肿瘤组织块；消化液为cock tail酶溶液，包括0.05％的Collagenase type IV、0.001％的DNase I和1500U/g Hyaluronidase type V；Ⅱ、分离收集单个细胞至50mL离心管中；用消化液洗涤无菌三角烧瓶2次，将所有液体转移至该50mL离心管中；将50mL离心管放在冰上静置10min后，以50
×
g离心力离心2min，转移上清液至新50mL离心管中，在400
×
g离心力下离心7min，弃上清，加入3mL缓冲液PBS+重悬细胞；Ⅲ、在新离心管中顺序加入3mL比重为1.088的Ficoll
‑
Hypaque，等体积的比重为1.075Ficoll
‑
Hypaque以及肿瘤组织细胞悬液，作不连续密度梯度离心，在500
×
g离心力下离心20min；Ⅳ、收集上下两层Ficoll
‑
Hypaque之间界面上的细胞悬液，即得到富含TIL的细胞悬液，用缓冲液PBS+洗细胞2次，细胞重悬后，70μm Mesh过滤，获得肿瘤组织TIL细胞单细胞悬液。7.根据权利要求5所述的大队列样品单细胞富集和混样建库测序方法，其特征在于，步骤S1中单细胞样品为循环肿瘤细胞时，单细胞样品的制备方法为：Ⅰ、将15mL全血样品加入试管，离心收集细胞，裂解RBC；向试管内加入缓冲液PBS+混匀，在室温，400
×
g离心力下离心7min后，去除上清液；Ⅱ、以0.5
‑
1mL缓冲液PBS+重悬细胞，每mL血样品中添加50μL富集用cock tail抗体，混匀，并在室温下孵育5min；富集用cock
‑
tail抗体为生物素标记的抗人CD2、CD14、CD16、CD19、CD45、CD61、CD66b和GlycophorinA抗体混合试剂；Ⅲ、将阴性选择磁珠颗粒添加到抗体和细胞悬液孵育的混合液中，每mL血样品来源细胞添加50μL阴性选择磁珠颗粒，添加PBS+缓冲液以将样品补充至10mL，轻轻上下吹打2
‑
3次混合；阴性选择磁珠为偶联有链霉亲和素的磁珠；Ⅳ、将试管放入磁铁中，室温孵育10min，吸取富集的细胞悬液到新的试管中；
Ⅴ
、重复步骤
Ⅲ‑
步骤Ⅳ，2次富集得到高纯度的循环肿瘤细胞。8.根据权利要求5所述的大队列样品单细胞富集和混样建库测序方法，其特征在于，步骤S1中单细胞样品由血或骨髓单个核细胞形成时，单细胞样品的制备方法为：Ⅰ、准备10mL全血或骨髓样品以及单个核细胞分离液，并在室温下平衡30min；Ⅱ、在一号50mL离心管中加入全血或骨髓样品和PBS各10mL，用移液枪轻柔吹打至混
匀；向二号50mL离心管底部添加10
‑
20mL单个核细胞分离液，倾斜离心管至45度，吸取20mL一号50mL离心管中PBS稀释的全血或骨髓样品沿壁缓慢加入到二号50mL离心管的单个核细胞分离液上层；然后将二号50mL离心管转移到离心机中，设置升速度设置为1，降速度为0，在常温，700
×
g离心力下离心30
‑
40min；Ⅲ、离心完成后，打圈吸取二号50mL离心管中PBMC细胞层的细胞，转移至15mL离心管中，加入缓冲液PBS+至终体积达到14mL，颠倒细胞悬液3
‑
5次混匀，将15mL离心管转移到离心机中，在常温，400
×
g离心力下离心7min；从离心机中取出离心管，观察离心后的细胞沉淀，在细胞沉淀中有红色时，进行红细胞裂解，具体方法为：a、使用宽口枪头弃15mL离心管中上清后加入红细胞裂解液3mL，置于4℃，裂红计时3
‑
5min；b、加入5
‑
7mL预冷的PBS+缓冲液轻柔颠倒混匀，将15mL离心管转移到离心机中，在常温，400
×
g离心力下离心7min；c、再次观察离心后的细胞沉淀，在细胞悬液中还有肉眼可见的红细胞沉淀掺杂其中，重复步骤a
‑
b，重复过程中裂红时间不超过3min；Ⅳ、离心完成后，从离心机中取出富集了细胞沉淀的离心管，弃除上清液，并将管口余液吸净；加入1mL的预冷缓冲液PBS+，轻柔吹打使细胞重悬，然后补加缓冲液PBS+至终体积10mL，再次将15mL离心管放到离心机中，在常温，400
×
g离心力下离心7min，收集细胞沉淀；
Ⅴ
、重复1
‑
2次步骤Ⅳ对细胞进行清洗去除背景；在显微镜下细胞沉淀中有大量血小板存在，使用缓冲液PBS+重悬细胞沉淀后，在常温，300
×
g离心力下离心5
‑
7min以去除血小板；
Ⅵ
、用100
‑
200μL缓冲液PBS+重悬细胞沉淀，将细胞悬液通过70μm Mesh以去除细胞团，获得单细胞悬液状态的血液单个核细胞样品。9.根据权利要求5所述的大队列样品单细胞富集和混样建库测序方法，其特征在于，步骤S1中单细胞样品为血液或骨髓中NK、NKT或T...

【专利技术属性】
技术研发人员：周经姣，杨程，王仲怡，王毅，周俊，王玉蝶，晏晴，
申请(专利权)人：武汉科技大学，
类型：发明
国别省市：