基于二次谐波的超分辨显微成像系统及成像方法技术方案

本发明专利技术公开了一种基于二次谐波的超分辨显微成像系统及成像方法，系统包括信号采集装置及成像处理终端，信号采集装置包括：脉冲激光器、半波片、格兰激光棱镜、螺旋相位板、角反射器、分束器、双色镜、振镜、扫描透镜、显微镜、三维移动平台及光电倍增管。上述的成像系统，脉冲激发光通过格兰激光棱镜后分离为第一激光及第二激光，螺旋相位板将第一激光的波前由高斯型转换成环形并进行光程调整，将环形激光及第二激光合束为组合光束，组合光束中两束激光的焦平面在空间上重合并聚焦照射样品，样品受激产生二次谐波信号进行放大处理得到谐波放大信号并输出至成像处理终端，成像处理终端处理得到样品图像，简化了成像设备并提高了成像分辨率。像分辨率。像分辨率。

【技术实现步骤摘要】
基于二次谐波的超分辨显微成像系统及成像方法


[0001]本专利技术涉及光学显微镜成像的
，尤其涉及一种基于二次谐波的超分辨显微成像系统及成像方法。

技术介绍

[0002]非线性光学描述了光与物质相互作用中入射场与产生的对应场极化的非线性关系，是物理光学最基本的基础学科分支之一，在激光技术、显微成像、材料科学以及量子光学等方向都有重要的意义。二次谐波成像是近年来发展迅速的一种光学成像技术，是一种生物结构检测和耐久追踪标记的新工具。二次谐波成像采用二阶非线性光学原理，光子在生物样品中只发生非线性散射，不涉及光化学过程，具有三维高分辨率，不需要荧光标记和对生物样品损伤小等特点，避免了荧光探针在标记和成像过程中遇到的许多固有缺点，是一种理想的活体成像方法，因此在生物医学研究中具有广阔的应用前景。二次谐波成像与双光子荧光成像的原理类似，区别在于谐波成像是光波倍频的过程，实际上不吸收光子的能量，也不产生荧光，而是发射出一个波长恰好为激发波长一半的出射光。这使得二次谐波成像系统与双光子成像系统基本兼容，只需要采用不同的滤波器过滤出二次谐波信号即可。但是，二次谐波成像技术仍然受光学衍射的限制，无法清晰辨别尺寸在200nm以下的生物体结构，因此限制了其在亚细胞结构中的应用。
[0003]为了突破光学衍射极限，超分辨成像技术应运而生。近几十年，基于不同原理的超分辨成像方法被陆续提出，如受激辐射损耗(Stimulated emission depletion,STED)显微镜、结构光照明显微镜(Structured illumination microscopy,SIM)和单分子定位显微镜(Single
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molecule localization microscopy,SMLM)等。但是，上述技术都是基于荧光“开/关”态的超分辨成像原理，不仅需要具有特殊光物理化学特性的荧光探针，而且在追求超分辨率极限时会产生一系列新的问题，比如高的激光功率、低的成像速度、复杂的成像系统和昂贵的实验成本等，导致成像成本高、成像效率低。此外，现有技术方法中的二次谐波成像技术存在成像效率不高的问题。

技术实现思路

[0004]本专利技术实施例提供了一种基于二次谐波的超分辨显微成像系统及成像方法，旨在解决现有技术方法中的二次谐波成像技术所存在的成像分辨率不高的问题。
[0005]第一方面，本专利技术实施例提供了一种基于二次谐波的超分辨显微成像系统，其中，所述系统包括信号采集装置及成像处理终端，所述信号采集装置包括：脉冲激光器、半波片、格兰激光棱镜、螺旋相位板、角反射器、分束器、双色镜、振镜、扫描透镜、显微镜、三维移动平台及光电倍增管；所述脉冲激光器的下游依次设置所述半波片及所述格兰激光棱镜，所述格兰激光棱镜与所述分束器之间形成第一光路及第二光路，所述第一光路中设有所述螺旋相位板及所述角反射器；所述半波片用于对所述脉冲激光器产生的脉冲激发光进行偏振方向调节，所述格兰激光棱镜用于对进行偏振方向调节后的脉冲激发光进行分离，得到
偏振方向不同的两束激光；所述两束激光分别经所述第一光路及所述第二光路传输至所述分束器，所述分束器对两束激光进行合束；所述螺旋相位板用于将激光的波前由高斯型转换成环形；所述角反射器用于对第一光路中传输的环形激光的光程进行调整，以调节第二光路中高斯型激光和第一光路中环形激光之间的脉冲间隔；所述分束器的下游设置所述双色镜，所述双色镜对来自所述分束器的激光进行透射并依次经所述振镜、所述扫描透镜、所述显微镜传输至所述三维移动平台中放置的样品；所述双色镜同时对所述三维移动平台中样品受激发产生的二谐波信号反射至所述光电倍增管；所述振镜用于对激发光进行同步扫描以实现对样品的面阵成像；所述扫描透镜用于收集面阵扫描的激光光束；所述显微镜用于聚焦光束照射所述三维移动平台中放置的样品并同时收集所述样品受激发产生的二次谐波信号；所述三维移动平台用于驱动所述样品进行三维移动；所述光电倍增管用于对所述双色镜反射的二谐波信号进行放大处理得到谐波放大信号；所述光电倍增管与所述成像处理终端进行电连接以输出谐波放大信号至所述成像处理终端，所述脉冲激光器与所述成像处理终端进行电连接以输出脉冲同步信号至所述程序处理终端；所述成像处理终端用于对所述谐波放大信号及所述脉冲同步信号进行处理得到样品图像。
[0006]第二方面，本专利技术实施例还提供了一种基于二次谐波的超分辨显微成像方法，其中，所述方法应用于上述第一方面的基于二次谐波的超分辨显微成像系统，所述方法包括：
[0007]开启所述脉冲激光器产生脉冲激发光经所述半波片调节偏振方向并经所述格兰激光棱镜分离得到第一激光及第二激光；所述第二激光为高斯型激光；
[0008]所述第一激光经所述第一光路传输，由所述第一光路中的螺旋相位板将所述第一激光的波前由高斯型转换成环形得到环形激光后通过所述角反射器进行光程调整；
[0009]所述分束器对所述环形激光及经所述第二光路传输的高斯型激光进行合束形成组合光束；
[0010]所述组合光束依次经过所述双色镜透射、所述振镜反射、所述扫描透镜透射及所述显微镜透射聚焦后照射所述样品；根据实时成像的样品图像调整所述扫描透镜及所述显微镜以进行光斑调节，使所述组合光束的环形激光及高斯型激光的焦平面在空间上重合；
[0011]所述样品被所述组合光束照射，受激发产生的二次谐波信号经所述显微镜透射、所述扫描透镜透射、所述振镜反射及所述双色镜反射后输入至所述光电倍增管；
[0012]所述光电倍增管对所述二次谐波信号进行放大处理，得到谐波放大信号后输出至所述成像处理终端；
[0013]所述成像处理终端获取所述谐波放大信号及所述脉冲激发光的脉冲同步信号进行处理得到样品图像。
[0014]第三方面，本专利技术实施例还提供了一种基于二次谐波的超分辨显微成像方法，其中，所述方法应用于上述第一方面的基于二次谐波的超分辨显微成像系统中的成像处理终端，所述方法包括：
[0015]根据所述脉冲同步信号确定对应的激光脉冲周期；
[0016]根据所述激光脉冲周期对所述谐波放大信号进行通道分离，得到第一通道对应的高斯点扩展函数图像及第二通道对应的环形点扩展函数图像；
[0017]从所述高斯点扩展函数图像中减去所述环形点扩展函数图像的二次谐波信号光子得到样品图像，所述样品图像为压缩所述高斯点扩展函数图像实现超分辨成像的图像。
[0018]本专利技术实施例提供了一种基于二次谐波的超分辨显微成像系统及成像方法，系统包括信号采集装置及成像处理终端，信号采集装置包括：脉冲激光器、半波片、格兰激光棱镜、螺旋相位板、角反射器、分束器、双色镜、振镜、扫描透镜、显微镜、三维移动平台及光电倍增管。上述的基于二次谐波的超分辨显微成像系统，通过脉冲激光器产生脉冲激发光经半波片调节偏振方向并经格兰激光棱镜分离得到第一激光及第二激光，螺旋相位板将第一激光的波前由高斯型转换成环形并通过角反射器进行光程调整，分束器对环形激光及第二激光进行合束形成组合光束，组合光束中本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于二次谐波的超分辨显微成像系统，其特征在于，所述系统包括信号采集装置及成像处理终端，所述信号采集装置包括：脉冲激光器、半波片、格兰激光棱镜、螺旋相位板、角反射器、分束器、双色镜、振镜、扫描透镜、显微镜、三维移动平台及光电倍增管；所述脉冲激光器的下游依次设置所述半波片及所述格兰激光棱镜，所述格兰激光棱镜与所述分束器之间形成第一光路及第二光路，所述第一光路中设有所述螺旋相位板及所述角反射器；所述半波片用于对所述脉冲激光器产生的脉冲激发光进行偏振方向调节，所述格兰激光棱镜用于对进行偏振方向调节后的脉冲激发光进行分离，得到偏振方向不同的两束激光；所述两束激光分别经所述第一光路及所述第二光路传输至所述分束器，所述分束器对两束激光进行合束；所述螺旋相位板用于将激光的波前由高斯型转换成环形；所述角反射器用于对第一光路中传输的环形激光的光程进行调整，以调节第二光路中高斯型激光和第一光路中环形激光之间的脉冲间隔；所述分束器的下游设置所述双色镜，所述双色镜对来自所述分束器的激光进行透射并依次经所述振镜、所述扫描透镜、所述显微镜传输至所述三维移动平台中放置的样品；所述双色镜同时对所述三维移动平台中样品受激发产生的二谐波信号反射至所述光电倍增管；所述振镜用于对激发光进行同步扫描以实现对样品的面阵成像；所述扫描透镜用于收集面阵扫描的激光光束；所述显微镜用于聚焦光束照射所述三维移动平台中放置的样品并同时收集所述样品受激发产生的二次谐波信号；所述三维移动平台用于驱动所述样品进行三维移动；所述光电倍增管用于对所述双色镜反射的二谐波信号进行放大处理得到谐波放大信号；所述光电倍增管与所述成像处理终端进行电连接以输出谐波放大信号至所述成像处理终端，所述脉冲激光器与所述成像处理终端进行电连接以输出脉冲同步信号至所述程序处理终端；所述成像处理终端用于对所述谐波放大信号及所述脉冲同步信号进行处理得到样品图像。2.根据权利要求1所述的基于二次谐波的超分辨显微成像系统，其特征在于，所述显微镜包括管镜、物镜及设置于所述管镜与所述物镜之间的四分之一玻片，所述管镜与所述物镜组合以将激光光束聚焦到焦平面照射所述样品，所述四分之一玻片将线偏振激光光转换成右旋圆偏振光。3.根据权利要求1所述的基于二次谐波的超分辨显微成像系统，其特征在于，所述光电倍增管与所述双色镜之间还设有滤光片。4.根据权利要求2或3所述的基于二次谐波的超分辨显微成像系统，其特征在于，所述成像处理终端包括相连接的时间相关单光子计数器及处理终端；所述时间相关单光子计数器与所述脉冲激光器进行电连接；所述时间相关单光子计数器用于接收二次谐波信号并对所述二次谐波信号的时空信息进行测量及记录，将得到的二次谐波信号的时空信息及脉冲同步信号传输至处理终端；所述处理终端用于获取脉冲同步信号及测量得到的二次谐波信号的时空信息并进行数据处理以得到样品图像。5.根据权利要求1
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3任一项所述的基于二次谐波的超分辨显微成像系统，其特征在于，通过所述角反射器调整所述第一光路中环形激光的光程，以...

【专利技术属性】
技术研发人员：严伟，王璐玮，郭勇，朱殷铷，周汉秋，屈军乐，
申请(专利权)人：深圳大学，
类型：发明
国别省市：