环磷鸟嘌呤核苷检测试剂、检测方法及应用技术

本发明专利技术涉及制药技术领域，尤其是涉及环磷鸟嘌呤核苷检测试剂、检测方法及应用。本发明专利技术提供的LC

【技术实现步骤摘要】
环磷鸟嘌呤核苷检测试剂、检测方法及应用


[0001]本专利技术涉及制药
，尤其是涉及环磷鸟嘌呤核苷检测试剂、检测方法及应用。

技术介绍

[0002]环磷鸟嘌呤核苷(cyclic guanosinc monophosphate,cGMP)广泛分布于各种组织中，cGMP是细胞内具有传递作用的第二信使，被G蛋白偶联受体激活后的蛋白激酶活化后，可以将胞外信号传导到细胞核。因此，检测动物血浆中cGMP浓度具有重要的生理意义，对于评价药物对动物分泌cGMP的影响也有重要作用。
[0003]目前对cGMP的检测方法主要有：薄层色谱法、放射性免疫法和酶联免疫法。由于cGMP在体内含量极低，文献报道参考区间为2.2～66.8pmol/mL，在已报道的cGMP检测方法中，缺乏对检测体系检出限、精密度、准确度和基质效应等方面的验证与评价，不能确保检测结果的实用性、准确性及可靠性。
[0004]鉴于此，特提出本专利技术。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于，针对现有cGMP测定方法存在的问题与不足，提供一种能准确、高效地评价人血浆中cGMP检测方法，期望通过该检测方法能够满足方法验证过程中对检出限、精密度、准确度和基质效应等方面的要求，从而用于药效评价中。
[0006]为了解决上述技术问题，实现上述目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0007]第一方面，本专利技术提供环磷鸟嘌呤核苷检测试剂，所述检测试剂包括标准品、质控品、内标标准品和样本萃取液；
[0008]所述标准品包括至少1个浓度稀释梯度的环磷鸟嘌呤核苷的甲醇溶液；
[0009]所述质控品包括至少1个浓度稀释梯度的环磷鸟嘌呤核苷的甲醇溶液；
[0010]所述内标标准品包括环磷鸟嘌呤核苷同位素内标物的甲醇溶液；
[0011]所述样本萃取液包括三氟乙酸水溶液；
[0012]所述检测试剂还包括稳定剂3
‑
异丁基
‑1‑
甲基黄嘌呤。
[0013]在可选的实施方式中，所述稳定剂的工作液为10～500mM的3
‑
异丁基
‑1‑
甲基黄嘌呤的甲醇溶液，优选为100mM。
[0014]在可选的实施方式中，所述样本萃取液的工作液为10～200g/L的三氯乙酸水溶液，优选为50g/L。
[0015]在可选的实施方式中，所述标准品环磷鸟嘌呤核苷的甲醇溶液的浓度稀释梯度为6个，其中环磷鸟嘌呤核苷的浓度范围为0.5～30ng/mL。
[0016]在可选的实施方式中，所述质控品包括HQC溶液和LQC溶液，所述HQC溶液和LQC溶液中环磷鸟嘌呤核苷的浓度选自1.5～22ng/mL；
[0017]优选地，所述检测试剂还包括将所述HQC溶液和LQC溶液的甲醇溶剂替换为血浆得
到的准确度工作液。
[0018]在可选的实施方式中，所述环磷鸟嘌呤核苷同位素内标物的甲醇溶液为
13
c,
15
N2‑
cGMP的甲醇溶液，其中
13
c,
15
N2‑
cGMP的浓度为15～2000ng/mL，优选为500ng/mL。
[0019]第二方面，本专利技术提供环磷鸟嘌呤核苷检测试剂盒，所述试剂盒包括前述实施方式任一项所述的检测试剂，所述检测试剂的剂型包括液体试剂、冻干粉或微球。
[0020]第三方面，本专利技术提供前述实施方式任一项所述检测试剂或前述实施方式所述试剂盒在药物开发、药物筛选或科学研究中的应用；
[0021]所述药物包括检测或调控血浆中环磷鸟嘌呤核苷含量的药物。
[0022]第四方面，本专利技术提供环磷鸟嘌呤核苷含量检测方法，所述检测方法包括，使用前述实施方式任一项所述检测试剂，或将前述实施方式所述试剂盒中所述检测试剂，采用液相色谱串联质谱方法对待测样本中的环磷鸟嘌呤核苷含量进行检测；
[0023]优选地，所述待测样本包括血浆或血清；
[0024]优选地，所述质谱采用电喷雾离子源，离子源参数为气帘气流速30～50psi，优选为40psi，喷撞气流速6～8psi，优选为7psi，离子化电压5000～6000V，优选为5500V，温度为450～600℃，优选为550℃，喷雾气和辅助加热气流速为40～60psi，优选为45psi；
[0025]所述液相色谱参数为流动相流速为0.4～0.8mL/min，优选为0.6mL/min，水相含有体积分数为0.1％的甲酸，有机相为乙腈；
[0026]液相检测时间1～1.8min期间，所述有机相占流动相总体积的90％，其余检测时间内，所述水相占流动相总体积的95％。
[0027]在可选的实施方式中，所述检测方法在检测前还包括LOD工作液的配制步骤，所述LOD工作液为环磷鸟嘌呤核苷的浓度为0.4～0.6ng/mL的环磷鸟嘌呤核苷的甲醇溶液，所述环磷鸟嘌呤核苷的浓度梯度不少于5。
[0028]应用本专利技术提供的cGMP检测试剂，配合本专利技术提供的LC
‑
MS/MS的cGMP检测方法，用于人血浆中cGMP检测，检测精密度的变异系数(％CV)在1.24％～3.70％之间，批间精密度的变异系数(％CV)在2.26％～3.70％之间；检测人血浆高、低样本回收率均在85％～115％之间；检测线性为0.5ng/mL～30ng/mL，所有点偏差均在
±
15％以内，线性回归：r＞0.99；对血浆样本和纯溶剂样本比对，基质效应为
‑
0.02％～
‑
9.45％。以上验证结果均证实了，本专利技术提供的检测方法能够推广用于评价药物对动物分泌环磷鸟嘌呤核苷的影响，具有重大的商业和科研价值。
附图说明
[0029]为了更清楚地说明本专利技术具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本专利技术的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0030]图1为空白血浆中加入标准品前环磷鸟嘌呤核苷的质谱图(m/z 346.0～m/z 152.0)；
[0031]图2为空白血浆中加入内标标准品前
13
C,
15
N2‑
环磷鸟嘌呤核苷的质谱图(m/z 349.0
‑
m/z 137.3)；
[0032]图3为空白血浆中加入标准品后环磷鸟嘌呤核苷的质谱图(m/z 346.0～m/z 152.0)；
[0033]图4为空白血浆中加入内标标准品后
13
C,
15
N2‑
环磷鸟嘌呤核苷的质谱图(m/z 349.0
‑
m/z 137.3)；
[0034]图5为空白血浆中加入标准品和内标标准品后的色谱图；
[0035]图6为本专利技术具体本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.环磷鸟嘌呤核苷检测试剂，其特征在于，所述检测试剂包括标准品、质控品、内标标准品和样本萃取液；所述标准品包括至少1个浓度稀释梯度的环磷鸟嘌呤核苷的甲醇溶液；所述质控品包括至少1个浓度稀释梯度的环磷鸟嘌呤核苷的甲醇溶液；所述内标标准品包括环磷鸟嘌呤核苷同位素的甲醇溶液；所述样本萃取液包括三氟乙酸水溶液；所述检测试剂还包括稳定剂3
‑
异丁基
‑1‑
甲基黄嘌呤。2.根据权利要求1所述的检测试剂，其特征在于，所述稳定剂的工作液为10～500mM的3
‑
异丁基
‑1‑
甲基黄嘌呤的甲醇溶液，优选为100mM。3.根据权利要求1所述的检测试剂，其特征在于，所述样本萃取液的工作液为10～200g/L的三氯乙酸水溶液，优选为50g/L。4.根据权利要求1所述的检测试剂，其特征在于，所述标准品环磷鸟嘌呤核苷的甲醇溶液的浓度稀释梯度为6个，其中环磷鸟嘌呤核苷的浓度范围为0.5～30ng/mL。5.根据权利要求1所述的检测试剂，其特征在于，所述质控品包括HQC溶液和LQC溶液，所述HQC溶液和LQC溶液中环磷鸟嘌呤核苷的浓度选自1.5～22ng/mL；优选地，所述检测试剂还包括将所述HQC溶液和LQC溶液的甲醇溶剂替换为血浆得到的准确度工作液。6.根据权利要求1所述的检测试剂，其特征在于，所述环磷鸟嘌呤核苷同位素内标物的甲醇溶液为
13
c,
15
N2‑
cGMP的甲醇溶液，其中
13
c,
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【专利技术属性】
技术研发人员：周立，郑佳，栗琳，张新星，周继福，丁亮，
申请(专利权)人：江苏豪思睦可生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：