一种基于PMAxx-LAMP-NALFA快速检测沙门氏菌活菌试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术涉及微生物检测技术领域，特别是涉及一种基于PMAxx

【技术实现步骤摘要】
一种基于PMAxx
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LAMP
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NALFA快速检测沙门氏菌活菌试剂盒及检测方法


[0001]本专利技术涉及微生物检测
，特别是涉及一种基于PMAxx
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LAMP
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NALFA快速检测沙门氏菌活菌试剂盒及检测方法。

技术介绍

[0002]沙门氏菌(Salmonella)是分布最为广泛的食源性致病菌之一，是引起世界各国大多数食品中毒事件的罪魁祸首。其常在蛋及其制品、肉类、乳制品等食品中检出。在资源有限、缺乏实验室和检测设备的地区，提供快速、精准的沙门氏菌现场检测方法对食品安全防控具有重要意义。
[0003]对沙门氏菌的检测方法主要有国标法、PCR法等。国标法是检测的“金标准”，但费时费力、成本高、专业性强，无法实现及时有效的检测。而PCR法检测精度高，时间较短，但是依赖于PCR仪器，难以满足实际现场检测的要求。而免疫层析技术方便快捷，适合于现场检测，但检测灵敏度较低，且无法区分死活菌导致检测精度较低。
[0004]环介导等温扩增(LAMP)是一种除PCR外的DNA扩增方法。该方法在恒温条件下扩增DNA，特异性强、速度快、效率高。检测时间比PCR短，扩增时不依赖热循环仪器，只需要一些简单的小型加热器便能实现扩增。LAMP与层析技术相结合的核酸层析(LAMP
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NALFA)技术，同时拥有核酸扩增技术的高灵敏度和免疫层析技术的可视性、便携性和易操作性，是一种快速、可视化的现场检测技术。但LAMP
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>NALFA技术如同LAMP技术和免疫层析技术一样，无法区分死活菌，死菌的存在会影响到该技术的检测精度。使用核酸染料，如叠氮溴化乙锭(EMA)和叠氮溴化丙锭(PMA)等，可以解决LAMP
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NALFA技术无法区分死活菌的缺点，实现对沙门氏菌的精准检测。

技术实现思路

[0005]针对现有技术的不足，本专利技术提供一种基于改良的PMA染料——PMAxx核酸染料，结合基于LAMP技术的PMAxx
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LAMP
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NALFA活菌检测试剂盒及其检测方法，能有效缩短检测时间，降低成本，提高检测精度，实现现场快速检测。
[0006]本专利技术首先提供了一种基于PMAxx
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LAMP
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NALFA快速检测沙门氏菌活菌检测试剂盒，包含PMAxx、LAMP扩增反应液和核酸检测试纸条。
[0007]优选地，所述LAMP扩增反应液为23μL，包括：0.2μM引物F3、0.2μM引物B3，1.6μM引物FIP、1.6μM引物BIP、0.8μM引物LF、0.8μM引物LB，2.5μL缓冲液，6mM Mg
2+
，0.6M甜菜碱，6U的Bst DNA聚合酶，1.4mM dNTP，此外还有20μL石蜡油起到液封作用。
[0008]所述引物FIP、BIP、F3、B3、LF、LB序列分别如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6所示。
[0009]进一步优选地，所述引物FIP的5
’
端标记FITC，LF的5
’
端标记生物素。
[0010]优选地，所述PMAxx浓度为2mM。
[0011]优选地，所述试剂盒还包括核酸检测试纸条运行缓冲液和阴性对照样品，运行缓冲液为含有2％S9的磷酸盐缓冲溶液，阴性对照样品为无核酸的DEPC水。
[0012]优选地，所述核酸检测试纸条包括样品垫、结合垫、NC膜、吸水垫及底板，所述NC膜上分别设有包被链霉亲和素的检测线T线以及包被有羊抗鼠IgG抗体或兔抗鼠IgG抗体的质控线C线，所述NC膜设置在所述底板上，所述样品垫、结合垫与所述NC膜靠近所述检测线一端依次连接，所述吸水垫与所述NC膜靠近所述质控线一端连接。
[0013]进一步优选地，所述核酸检测试纸条的结合垫的制备步骤如下：制备彩色微球标记FITC抗体，将彩色微球标记FITC抗体稀释于结合垫处理液，将所述溶液滴加至所述结合垫上，45℃烘干3～4小时。
[0014]优选地，所述核酸检测试纸条的检测线和质控线的制备步骤如下：将磷酸盐缓冲溶液稀释后的链霉亲和素和羊抗鼠IgG抗体，分别划线于所述NC膜上，包被浓度为0.5～1.5mg/mL，置于37℃烘箱过夜。
[0015]优选地，所述核酸检测试纸条具有检测腔，并设有与所述检测腔连通的加样槽和观察窗，所述核酸检测试纸条安装在所述检测腔内。
[0016]本专利技术还提供了上述基于PMAxx
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LAMP
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NALFA快速检测沙门氏菌活菌检测试剂盒的检测方法，包括如下步骤：
[0017]S1将待测样品与所述的PMAxx混匀，使体系中PMAxx终浓度为2～20μM，避光染色5～20min，在核酸标记仪进行5～15min的光活化处理，10000rpm离心2min后，用磷酸盐缓冲溶液重悬，再进行离心，用TE水重悬，100℃加热10min，冰浴5min，12000rpm离心2min；
[0018]S2用移液枪吸取2μL步骤S1离心后的上清液加入到所述的LAMP扩增反应液中，60～65℃扩增30～60min后85℃加热5min；
[0019]S3向所述的核酸检测试纸条加入2～10μL扩增样品，再加入70～98μL运行缓冲液，反应5～15min，根据核酸检测试纸条显色带判断检测结果。
[0020]与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：
[0021](1)本专利技术采用的PMAxx染料，该染料不能通过细胞膜，只能选择性地渗透到膜破损的细胞(死菌)中。染料嵌入双链DNA后暴露在强烈的可见光下会形成与DNA形成共价连接，DNA与染料结合后无法扩增，而活菌DNA不会受到影响。使用该染料处理细菌后进行LAMP扩增，能有效区分细菌的死活性，能消除死菌带来的假阳性干扰；
[0022](2)本专利技术的使用不依赖大型仪器，适合现场检测。
附图说明
[0023]图1为本专利技术所述基于PMAxx
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LAMP
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NALFA快速检测沙门氏菌活菌检测试纸条的结构示意图
[0024]图2为本专利技术所述PMAxx
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LAMP
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NALFA快速检测沙门氏菌活菌检测结果图，注：1：空白；2：1
×
106CFU/mL；3：1
×
105CFU/mL；4：1
×
104CFU/mL；5：1
×
103CFU/mL；6：1
×
102CFU/mL；7：1
×
101CFU/mL。
具体实施方式
[0025]下面将结合本专利技术实施例，对本专利技术的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所
描述的实施例仅仅是本本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于PMAxx
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LAMP
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NALFA快速检测沙门氏菌活菌检测试剂盒，其特征在于，包含PMAxx、LAMP扩增反应液和核酸检测试纸条。2.根据权利要求1所述的基于PMAxx
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LAMP
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NALFA快速检测沙门氏菌活菌检测试剂盒，其特征在于，所述LAMP扩增反应液为23μL，包括：0.2μM引物F3、0.2μM引物B3，1.6μM引物FIP、1.6μM引物BIP、0.8μM引物LF、0.8μM引物LB，2.5μL缓冲液，6mM Mg
2+
，0.6M甜菜碱，6U的Bst DNA聚合酶，1.4mM dNTP，此外还有20μL石蜡油液封；所述引物FIP、BIP、F3、B3、LF、LB序列分别如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6所示。3.根据权利要求2所述的基于PMAxx
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LAMP
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NALFA快速检测沙门氏菌活菌检测试剂盒，其特征在于，所述引物FIP的5
’
端标记FITC，LF的5
’
端标记生物素。4.根据权利要求1所述的基于PMAxx
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LAMP
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NALFA快速检测沙门氏菌活菌检测试剂盒，其特征在于，所述PMAxx浓度为2mM。5.根据权利要求1所述的基于PMAxx
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LAMP
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NALFA快速检测沙门氏菌活菌检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括核酸检测试纸条运行缓冲液和阴性对照样品，运行缓冲液为含有2％S9的磷酸盐缓冲溶液，阴性对照样品为无核酸的DEPC水。6.根据权利要求1所述的基于PMAxx
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LAMP
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NALFA快速检测沙门氏菌活菌检测试剂盒，其特征在于，所述核酸检测试纸条包括样品垫、结合垫、NC膜、吸水垫及底板，所述NC膜上分别设有包被链霉亲和素的检测线T线以及...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵力超，林丽，谭有将，梁德智，文媛怡，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：