一种用于迟缓爱德华菌的环介导等温扩增检测方法及应用技术

本发明专利技术涉及一种对4种血清型迟缓爱德华菌的环介导等温扩增（LAMP）检测方法及应用。本发明专利技术以迟缓爱德华菌G6053，G6057，G6058，G6059的O抗原基因簇内的特异基因，即wzx基因为靶基因，设计并筛选了对上述4种血清型迟缓爱德华菌的各自四条引物，并建立了一种环介导等温扩增（LAMP）反应体系，为迟缓爱德华菌的检测和血清学分型提供了相应技术。利用本发明专利技术的LAMP体系检测迟缓爱德华菌，并且对其进行血清学分型，具有操作简便和快速高效的优点。具有操作简便和快速高效的优点。

【技术实现步骤摘要】
一种用于迟缓爱德华菌的环介导等温扩增检测方法及应用


[0001]本专利技术属于细菌检测方法
，涉及用于迟缓爱德华菌4种血清型的环介导等温扩增检测方法及应用。

技术介绍

[0002]迟缓爱德华菌可在大多数水环境中生存，是一种人畜共患病菌，可对多种经济型鱼类造成感染，造成严重的经济损失。同时，该菌也可以感染哺乳动物及人类，其中最常见的感染疾病是胃肠炎，若不慎引发肠外或全身感染，还可导致较高的死亡率。
[0003]环介导等温扩增（Loop
‑
mediated Isothermal Amplification，LAMP）技术可在等温（60
‑
65℃）条件下，短时间（通常是一小时内）内进行核酸扩增，通过反应前后的反应液颜色变化或简单的DNA琼脂糖凝胶电泳来观察实验结果。与常规PCR相比，不需要模板的热变性、温度循环等过程，且在灵敏度、特异性和检测范围等指标上甚至优于PCR技术，检测成本则低于荧光定量PCR。
[0004]其技术原理为：60
‑
65℃是双链DNA复性及延伸的中间温度，DNA在65℃左右处于动态平衡状态。因此，DNA在此温度下合成是可能的。利用4种特异引物和依靠一种高活性链置换DNA聚合酶，使得链置换DNA合成在不停地自我循环。
[0005]扩增分两个阶段：第1阶段为起始阶段，任何一个引物向双链DNA的互补部位进行碱基配对延伸时，另一条链就会解离，变成单链。上游内部引物FIP的F2序列首先与模板F2c结合，在链置换型DNA聚合酶的作用下向前延伸启动链置换合成。外部引物F3与模板F3c结合并延伸，置换出完整的FIP连接的互补单链。FIP上的F1c与此单链上的F1为互补结构。自我碱基配对形成环状结构。以此链为模板，下游引物BIP与B3先后启动类似于FIP和F3的合成，形成哑铃状结构的单链。迅速以3
’
末端的F1区段为起点。以自身为模板，进行DNA合成延伸形成茎环状结构。该结构是LAMP基因扩增循环的起始结构。
[0006]第2阶段是扩增循环阶段。以茎环状结构为模板，FIP与茎环的F2c区结合。开始链置换合成，解离出的单链核酸上也会形成环状结构。迅速以3
’
末端的B1区段为起点，以自身为模板，形成DNA合成延伸及链置换，形成长短不一的2条新茎环状结构的DNA，BIP引物上的B2与其杂交，启动新一轮的扩增，且产物DNA长度增加一倍。在反应体系中添加2条环状引物LF和LB，它们也分别与茎环状结构结合启动链置换合成。周而复始，扩增的最后产物是具有不同个数茎环结构、不同长度DNA的混合物，且产物DNA为扩增靶序列的交替反向重复序列。

技术实现思路

[0007]为实现上述目的，本专利技术公开了一种对迟缓爱德华菌4个血清型血清型菌株进行检测与分型的LAMP引物，该引物含有FIP 引物、F3引物、BIP引物以及B3引物。
[0008]LAMP引物的设计主要是针对靶基因的六个不同的区域，基于靶基因
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3'端的F3c、F2c和Flc区以及
ꢁ
5'端的Bl、B2和B3区等6个不同的位点设计4种引物。
[0009]Primer)
ꢁ
Inner
ꢁ
FIP(Forward：上游内部引物，由F2区和F1C区域组成，F2区与靶基
因3
’
端的F2c区域互补，F1C区与靶基因
ꢁ
5'端的Flc区域序列相同。
[0010]F3引物：上游外部引物Primer)
ꢁ
Outer
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(Forward，由F3区组成，并与靶基因的F3c区域互补。
[0011]BIP引物：下游内部引物Primer)
ꢁ
Inner
ꢁ
(Backward，由B1C和B2区域组成，B2区与靶基因
ꢁ
3'端的B2c区域互补，B1C域与靶基因
ꢁ
5'端的Blc区域序列相同.B3引物：下游外部引物Primer)
ꢁ
Outer
ꢁ
(Backward，由B3区域组成，和靶基因的B3c区域互补。
[0012]其主要特征在于上述LAMP引物是在迟缓爱德华菌G6053，G6057，G6058，G6059的wzx基因中分别选取的4个DNA片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1
‑
SEQ ID NO:16所示。
[0013]本专利技术还提供了一种环介导等温扩增（LAMP）反应体系，组成成分如下：本专利技术还提供了一种环介导等温扩增（LAMP）反应体系，组成成分如下：本专利技术进一步公开了上述环介导等温扩增（LAMP）反应体系在用于检测迟缓爱德华菌4个血清型菌株方面的应用。实验结果显示，本专利技术公开的环介导等温扩增反应体系可用于检测迟缓爱德华菌4个血清型的准确、快速检测。
[0014]本专利技术主要提供了利用环介导等温扩增（LAMP）方法，对迟缓爱德华菌4个血清型进行检测的技术手段。其积极效果在于：（1）首次公开了利用环介导等温扩增（LAMP）方法，对迟缓爱德华菌4个血清型菌株进行检测的技术手段，对于该菌的临床检测和流行病学监控提供了有效方法。
[0015]（2）操作简便，无需昂贵反应设备，在普通水域环境中即可完成反应。
[0016]（3）检测时间短：利用该技术手段，自获得基因组DNA粗提液后，可在约1.5小时内
完成检测。
附图说明
[0017]图1 迟缓爱德华菌G6053 LAMP反应特异性检测：在迟缓爱德华菌LAMP体系1中分别加入迟缓爱德华菌G6053、G6057、G6058、G6059的基因组进行环介导等温扩增反应，除G6053基因组外，电泳检测均无扩增条带出现，说明迟缓爱德华菌LAMP体系1特异性良好；其中，M表示DL2000 DNA Marker，1表示去离子水，2表示G6053基因组，3表示G6057基因组；4表示G6058基因组；5表示G6059基因组；图2 迟缓爱德华菌G6057 LAMP反应特异性检测：在迟缓爱德华菌LAMP体系2中分别加入迟缓爱德华菌G6053、G6057、G6058、G6059的基因组进行环介导等温扩增反应，除G6057基因组外，电泳检测均无扩增条带出现，说明迟缓爱德华菌LAMP体系2特异性良好；其中，M表示DL2000 DNA Marker，1表示去离子水，2表示G6057基因组，3表示G6053基因组；4表示G6058基因组；5表示G6059基因组；图3迟缓爱德华菌G6058 LAMP反应特异性检测：在迟缓爱德华菌LAMP体系3中分别加入迟缓爱德华菌G6053、G6057、G6058、G6059的基因组进行环介导等温扩增反应，除G6058基因组外，电泳检测均无扩增条带出现，说明迟缓爱德华菌LAMP体系3特异性良好；其中，M表示DL2000 DNA Marker，1表示去离子水，2表示G6058基因组，3表示G6本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种对不同血清型迟缓爱德华菌分别特异的LAMP引物，其特征是在迟缓爱德华菌G6053，G6057，G6058，G6059的wzx基因中分别选取的4个DNA片段，其核苷酸序列依次如SEQ ID NO:1
‑
SEQ ID NO...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭玺，刘斌，武潘，王婧，
申请(专利权)人：南开大学，
类型：发明
国别省市：