本文的分离外泌体的方法包括提供具有螺旋形通道的微流体装置，该螺旋形通道与两个入口端口和至少两个出口端口流体连通。两个入口端口中的一个靠近螺旋形通道的内壁，另一个入口端口靠近其外壁。该出口端口中的至少一个与用于储存分离的外泌体的容器流体连通。将血液样本和鞘液引入靠近外壁和内壁的入口端口以在螺旋形通道中形成稀释的样本，并驱动通过以在容器中回收外泌体。与第一出口端口流体连通的螺旋形通道包括第一出口通道，该第一出口通道将该螺旋形通道连接到该第一出口端口，并且比分别将该螺旋形通道连接到其他出口端口的其他出口通道更长。其他出口通道更长。其他出口通道更长。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】使用离心力从全血中直接和可扩展地分离循环胞外囊泡
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求2019年10月21日提交的新加坡专利申请第10201909776U号的优先权，其内容出于所有目的通过引用整体并入本文。
[0003]本公开涉及从血液中分离外泌体的方法。本公开还涉及可操作以执行该方法的微流体装置以及基于该微流体装置和方法鉴定糖尿病(diabetes mellitus)的方法。
技术介绍
[0004]胞外囊泡(EV)，包括外泌体(～50至200nm)和微泡(～100nm至1μm)，由细胞在生理或病理诱因下产生，并作为细胞间通讯的媒介。虽然血液中的循环EV是癌症和多尿病(diabetes)的有希望的诊断生物标志物，但血源性外泌体的分离涉及费力的超速离心或具有高蛋白质污染的商业沉淀试剂盒。
[0005]细胞成分高(约50％v/v)的血液的复杂性以及EV和血小板之间尺寸范围相似(～2至3μm)对EV的分离提出了巨大的技术挑战。EV分离的当前标准可能涉及多步差速和超速离心(通常～1,000
×
g，持续10分钟以去除细胞成分；～2,000
×
g，持续20分钟以获得无血小板血浆；～20,000
×
g，持续60分钟沉淀微泡；～175,000
×
g，持续70分钟以沉淀外泌体)。这样的标准可能通常用于纯化EV，但该过程很费力，并且EV的收率和纯度可能高度依赖于用户操作和采血方法。
[0006]在一个示例中，基于免疫磁珠的外泌体捕获似乎更有效，但可能取决于结合靶标而导致分析有偏差。
[0007]基于过滤和/或沉淀的商业产品也可用于从血清中分离EV。然而，尽管它们对用户友好，但纯度低于传统/标准方法，并且在洗脱后往往存在丧失EV功能性的风险。
[0008]已经开发了其他几种外泌体分离和检测微流体平台，其中最常见的是在微通道表面或微珠上使用成熟的外泌体表面标志物(CD81或CD63)进行亲和捕获。这些技术在血浆或血清样本中得到了证明，这些样本需要额外的样本处理(离心)步骤来使血细胞耗竭。这些装置的通量和流速往往较低(～4至20μL min
‑1)，因为它们需要促进外泌体在通道内结合或与捕获珠混合。这恰好限制了直接全血处理，因为大的红细胞会产生背景干扰，该背景干扰显著阻碍EV与抗体功能化表面的结合。
[0009]另一种策略是经由基于尺寸的排阻来通过膜错流过滤或通过使用硅纳米线的微孔纤毛微柱分离外泌体。这些无标记方法在捕捉EV时往往是非选择性的，从而导致更高的收率和无偏差的分析。通量可以通过更大的过滤占用空间(filtration footprint)轻松扩大，但装置操作在很大程度上受到堵塞问题和EV回收率低的限制。
[0010]在另一个示例中，开发了用于亚微米二元颗粒分选的被称为“高分辨率迪恩流分级(High
‑
resolution Dean Flow Fractionation，HiDFF)”的微流体技术。HiDFF利用颗粒跨通道的非平衡差速迪恩迁移来实现小的微米颗粒和纳米颗粒(～50nm至1μm)的基于尺寸
的连续分离。这提供了在高通量(～70至100μL min
‑1)下以高分离分辨率对小颗粒进行分级，并且可以在芯片外连续收集纯化的颗粒以用于下游分析。然而，这种技术可能是特定的，并且不能充分提供外泌体分离所需的分辨率。
[0011]因此，需要提供一种解决上述一个或多个限制的解决方案。该解决方案至少应提供分离EV(例如外泌体)的方法和/或具有低于300nm分离分辨率的多路EV分级工具。该解决方案还应提供从全血中直接分离循环外泌体的能力。
技术实现思路
[0012]在第一方面，提供了从血液中分离外泌体的方法，该方法包括：
[0013]提供具有螺旋形通道的微流体装置，该螺旋形通道与(i)两个入口端口和(ii)至少两个出口端口流体连通，其中，该两个入口端口中的一个靠近该螺旋形通道的内壁，另一个入口端口靠近该螺旋形通道的外壁，其中，该出口端口中的至少一个与被配置为储存分离的外泌体的容器流体连通；
[0014]将血液样本引入靠近该外壁的入口端口，并将鞘液引入靠近该内壁的入口端口，以在该螺旋形通道中形成稀释的样本；
[0015]驱动稀释后的样本通过该螺旋形通道；和
[0016]将外泌体回收于该容器中，
[0017]其中，该至少两个出口端口包括第一出口端口，该第一出口端口与该被配置为储存分离的外泌体的容器流体连通，
[0018]其中，与该第一出口端口流体连通的该螺旋形通道包括第一出口通道，该第一出口通道将该螺旋形通道连接到该第一出口端口，并且比分别将该螺旋形通道连接到其他出口端口的其他出口通道更长。
[0019]在另一方面，提供了可操作以从血液中分离外泌体的微流体装置，该微流体装置包括：
[0020]螺旋形通道，其与(i)两个入口端口和(ii)至少两个出口端口流体连通，其中，该两个入口端口中的一个靠近该螺旋形通道的内壁，另一个入口端口靠近该螺旋形通道的外壁；和
[0021]与该出口端口中的至少一个流体连通的容器，其中，该容器被配置为储存分离的外泌体，
[0022]其中，该至少两个出口端口包括第一出口端口，该第一出口端口与该被配置为储存分离的外泌体的容器流体连通，
[0023]其中，与该第一出口端口流体连通的该螺旋形通道包括第一出口通道，该第一出口通道将该螺旋形通道连接到该第一出口端口，并且比分别将该螺旋形通道连接到其他出口端口的其他出口通道更长。
[0024]在另一个方面，提供了鉴定糖尿病的方法，该方法包括：
[0025]提供血液样本并将该血液样本引入上述方面的各个实施例中描述的微流体装置；
[0026]操作该微流体装置；和
[0027]根据上述第一方面的各个实施例中描述的方法分离外泌体以鉴定糖尿病。
附图说明
[0028]附图不一定按比例绘制，而是通常重点调放在说明本公开的原理上。在以下描述中，参考以下附图描述了本公开的各个实施例，其中：
[0029]图1A涉及描绘本公开的两入口、四出口螺旋微通道的设计的装置示意图。
[0030]图1B示出循环EV与全血的分离。在图1B中，在迪恩涡流的影响下，小颗粒(EVs和血小板a
p
/h<0.07)横向向内壁迁移。在内壁附近，颗粒的最内层瞬态位置由取决于尺寸的壁诱导惯性升力(F
WL
)确定，可用于以优越的分辨率进行小颗粒分离。
[0031]图2A显示了50nm珠子的荧光图像和CFD预测的出口区域处的流线，其中在出口1中具有0
×
阻力通道长度。ANSYS FLUENT用于模拟样本入口的流线。
[0032]图2B显示了50nm珠子的荧光图像和CFD预测的出口区域处的流线，其中在出口1中具有2.5...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种从血液中分离外泌体的方法，所述方法包括：提供包括螺旋形通道的微流体装置，所述螺旋形通道与(i)两个入口端口和(ii)至少两个出口端口流体连通，其中，所述两个入口端口中的一个靠近所述螺旋形通道的内壁，另一个入口端口靠近所述螺旋形通道的外壁，其中，所述出口端口中的至少一个与被配置为储存分离的外泌体的容器流体连通；将血液样本引入靠近所述外壁的入口端口，并将鞘液引入靠近所述内壁的入口端口，以在所述螺旋形通道中形成稀释的样本；驱动稀释后的样本通过所述螺旋形通道；和将所述外泌体回收于所述容器中，其中，所述至少两个出口端口包括第一出口端口，所述第一出口端口与被配置为储存分离的外泌体的所述容器流体连通，其中，与所述第一出口端口流体连通的所述螺旋形通道包括第一出口通道，所述第一出口通道将所述螺旋形通道连接到所述第一出口端口，并且比分别将所述螺旋形通道连接到其他出口端口的其他出口通道更长。2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述方法不包括离心步骤。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，引入所述血液样本和所述鞘液包括以与引入所述血液样本的流速相比更高的流速引入所述鞘液。4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中，引入所述血液样本和所述鞘液包括：将所述血液样本引入靠近所述外壁的入口端口，并且将所述鞘液引入靠近所述内壁的入口端口，流速比为1:5至1:50。5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，螺旋形通道定义为具有：150μm至500μm的宽度；30μm至100μm的高度；3cm至10cm的长度；3比7的宽高比；或0.3cm至1cm的曲率半径。6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中，所述螺旋形通道为半螺旋形通道，其中，所述半螺旋形通道具有5mm至25mm的长度。7.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中：所述两个入口端口以所述螺旋形通道围绕所述入口端口水平螺旋的方式布置，并且所述至少两个出口端口远离所述螺旋形通道布置；或所述两个入口端口远离所述螺旋形通道布置，并且所述至少两个出口端口以所述螺旋形通道围绕所述至少两个出口端口水平螺旋的方式布置。8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中，驱动所述稀释后的样本包括驱动所述稀释后的样本在所述螺旋形通道中流动以具有20至100的雷诺数；和2至10的迪恩数。9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中，所述第一出口通道具有0.5cm至1.5cm的长度。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中，所述至少两个出口端口包括四个出口端口。11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中，所述螺旋形通道逐渐扩大至500μm至3000μm的宽度。12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中，所述第一出...
【专利技术属性】
技术研发人员：侯翰伟，郑卉敏，梁生元，
申请(专利权)人：南洋理工大学，
类型：发明
国别省市：
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