一种同时检测赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮的三维DNA纳米镊子及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种同时检测赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮的三维DNA纳米镊子及其制备方法和应用，涉及生物检测技术领域。本发明专利技术所述三维DNA纳米镊子，当目标物存在时，三维DNA纳米镊子中目标物的适配体与目标物发生特异性结合，从DNA纳米镊子中脱落下来，从而产生“闭合”状态，导致荧光基团和猝灭基团的间距减小，从而使荧光强度减小，荧光信号的强弱与目标物的含量具有一定的相关性。通过三维DNA纳米镊子的的开合状态时的荧光值强度达到对目标物进行定量检测的目的，在检测真菌毒素和小分子领域具备广阔的应用前途。域具备广阔的应用前途。域具备广阔的应用前途。

【技术实现步骤摘要】
一种同时检测赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮的三维DNA纳米镊子及其制备方法和应用


[0001]本专利技术属于生物检测
，具体涉及一种同时检测赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮的三维DNA纳米镊子及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]DNA不但可以承载遗传信息，还能作为基元承担纳米材料的组建，DNA具备的程序化识别和组装功能可用来精准调控纳米材料的结构。DNA纳米技术是以DNA作为主要材料以实现某种特定功能的技术，主要包括有DNA纳米结构和DNA纳米机器等，可以应用于医学、药学、化学及生物检测等多种领域。相较于有机大分子或无机分子等材料，DNA纳米结构具有结构灵活，程序化设计，生物相容性高，成本低廉等特点，在食品安全检测等方面的应用逐渐受到认可。
[0003]核酸分子因其分子尺度小、结构稳定、操作简便可行等优点，在取代传统分子来构建纳米材料方面具有巨大的应用前景。最近几年，DNA分子不但在构建多维结构方面优势显著，也在组装灵活操作的分子机器方面不断开发研究。随着DNA分子双螺旋结构的结合和解离过程的交替进行，DNA分子受到外部刺激后也会交替进行两种状态的变化。这种DNA分子机器不仅优于DNA纳米结构，同时也拥有了较为智能的工作模式，将DNA纳米
发展为由特定金属离子或分子等控制的精密纳米级机器零件。在未来有希望通过组合多个DNA分子机器零件，来组建人工生物机器去执行更复杂的任务。DNA分子机器和DNA机器人等智能性的新型DNA纳米技术受到广泛关注，其特点就是可以对外界环境给予的各种刺激做出相应的反应。DNA梭子(DNA shuttle)、DNA步行者(DNA walker)和DNA镊子(DNA tweezers)等是主要的DNA分子机器，能够不受外界环境(如核酸、pH或金属离子等)的干扰来顺利开展逻辑门运算和生物传感等各种动作。2006年，DNA镊子在DNA分子机器中首次被提出并得到广泛的关注。DNA镊子是一种动态的DNA纳米装置，“打开”和“闭合”的状态能通过DNA燃料链对其进行切换。DNA镊子在参与反应时，可清晰地看到发生荧光共振时产生的能量转移，这与在DNA镊子臂上配置的荧光分子有关。DNA镊子在特异性识别目标物的问题上有较好的优势，但是DNA镊子成本较高，因此，后期需要对该方法仍然需要进一步探索与研究，以降低其成本并扩大应用范围。

技术实现思路

[0004]有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种同时检测赭曲霉毒素A(OTA)和玉米赤霉烯酮(ZEN)的三维DNA纳米镊子及其制备方法和应用，通过测量荧光强度的变化实现OTA和ZEN的同时定量检测。
[0005]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0006]本专利技术提供了一种同时检测赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮的三维DNA纳米镊子，所述三维DNA纳米镊子包含P1～P8共8条寡核苷酸链，其中P1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所
示，P2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，P3的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，P4的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，P5的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，P6的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，P7的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，P8的核苷酸序列如SEQ ID NO.87所示；
[0007]在P5和P6的核苷酸序列中各包含一个荧光基团和一个淬灭基团。
[0008]优选的，所述荧光基团包括Cy5和Cy3；所述淬灭基团包括BHQ
‑
3和BHQ
‑
2。
[0009]优选的，在P5的5
’
端连接Cy5，3
’
端连接BHQ
‑
3；在P6的5
’
端连接BHQ
‑
2，3
’
端连接Cy3。
[0010]本专利技术还提供了上述三维DNA纳米镊子的制备方法，包括以下步骤：将P1～P8共8条寡核苷酸链等量混合后，依次经过95℃加热3min，65℃孵育3min，50℃孵育30min，37℃孵育30min和25℃孵育30min，得“打开”状态的三维DNA纳米镊子。
[0011]优选的，所述等量混合，包括将所述8条寡核苷酸链分别利用杂交缓冲液稀释成10μM，各取10μL进行混合。
[0012]本专利技术还提供了上述三维DNA纳米镊子在同时检测赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮中的应用。
[0013]本专利技术还提供了一种同时检测待测样品中赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮的方法，包括以下步骤：(1)分别利用不同浓度的赭曲霉毒素A标准品和玉米赤霉烯酮标准品和“打开”状态的三维DNA纳米镊子在37℃孵育60min后，测量荧光强度并绘制标准曲线；
[0014](2)将待测样品与“打开”状态的三维DNA纳米镊子在37℃孵育60min，将测量得到的荧光强度带入步骤(1)所述标准曲线，测定赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮的存在和浓度。
[0015]优选的，所述赭曲霉毒素A标准品的浓度包括0.02ng/mL、0.1ng/mL、0.2ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、100ng/mL和200ng/mL；
[0016]所述玉米赤霉烯酮标准品的浓度包括0.05ng/mL、0.1ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL和500ng/mL。
[0017]优选的，所述待测样品包括食品。
[0018]优选的，测量荧光强度时，设定荧光分光光度计的参数如下：扫描速度为3000nm/min，激发波长、发射起始波长和终止波长分别为535、535和800nm，增益为15档。
[0019]有益效果：本专利技术提供了一种同时检测赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮的三维DNA纳米镊子，以常规的平面镊子为标准，综合平面镊子的运作机理和空间四面体的结构特点，获得本专利技术包含空间结构的三维DNA纳米镊子。本专利技术所述三维DNA纳米镊子，用DNA双链来组建四面体的各条棱，可显著提高结构的稳定性。当目标物存在时，三维DNA纳米镊子中目标物的适配体与目标物发生特异性结合，从DNA纳米镊子中脱落下来，从而产生“闭合”状态，导致荧光基团和猝灭基团的间距减小，从而使荧光强度减小，荧光信号的强弱与目标物的含量具有一定的相关性。通过三维DNA纳米镊子的的开合状态时的荧光值强度达到对目标物进行定量检测的目的。在本专利技术实施例中，在三维DNA纳米镊子的四个悬臂上分别修饰荧光基团Cy5、BHQ
‑
2、Cy3和BHQ
‑
3，通过OTA及ZEN和核酸适配体的特异性识别，三维DNA纳米镊子由“打开”状态变为“闭合”状态会引起荧光强度的变化。经验证，所述三维DNA纳米镊子对OTA和ZEN的LOD分别为0.0323和0.0375ng/mL，且在0.2～200和0.5～50ng/mL范围内表现出良好的线性关系，并且在真实样品的加标回收率中展示出优异本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种同时检测赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮的三维DNA纳米镊子，其特征在于，所述三维DNA纳米镊子包含P1～P8共8条寡核苷酸链，其中P1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，P2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，P3的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，P4的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，P5的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，P6的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，P7的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，P8的核苷酸序列如SEQ ID NO.87所示；在P5和P6的核苷酸序列中各包含一个荧光基团和一个淬灭基团。2.根据权利要求1所述三维DNA纳米镊子，其特征在于，所述荧光基团包括Cy5和Cy3；所述淬灭基团包括BHQ
‑
3和BHQ
‑
2。3.根据权利要求1或2所述三维DNA纳米镊子，其特征在于，在P5的5
’
端连接Cy5，3
’
端连接BHQ
‑
3；在P6的5
’
端连接BHQ
‑
2，3
’
端连接Cy3。4.权利要求1～3任一项所述三维DNA纳米镊子的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将P1～P8共8条寡核苷酸链等量混合后，依次经过95℃加热3min，65℃孵育3min，50℃孵育30min，37℃孵育30min和25℃孵育30min，得“打开”状态的三维D...

【专利技术属性】
技术研发人员：任舒悦，高志贤，陈瑞鹏，周焕英，彭媛，白家磊，李双，韩殿鹏，秦康，王瑜，李森，贾雪霞，
申请(专利权)人：军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所，
类型：发明
国别省市：