一种检测5种鹅膏肽类毒素、脱磷裸盖菇素和蟾蜍色胺的方法技术

本申请提供一种检测5种鹅膏肽类毒素、脱磷裸盖菇素和蟾蜍色胺的方法，该方法通过实验条件的优化，首次建立了超高效液相色谱

【技术实现步骤摘要】
一种检测5种鹅膏肽类毒素、脱磷裸盖菇素和蟾蜍色胺的方法


[0001]本专利技术属于检测
，具体涉及一种5种鹅膏肽类、脱磷裸盖菇素和蟾蜍色胺的检测方法。

技术介绍

[0002]蘑菇属于大型真菌，包括野生食用菌和药用菌，其中少数为毒蘑菇。毒蘑菇含不同类型致害毒素。19世纪60年代，人类首次从毒蝇鹅膏菌Amanita muscaria(L.)发现有毒毒素。目前已报道了毒蘑菇含九大类毒素：鹅膏毒环肽、单甲基肼毒素、丝膜菌毒素、毒蝇碱、鹅膏蕈氨酸、鬼伞菌素、裸盖菇素和脱磷酸裸盖菇素、胃肠道刺激剂以及亚稀褶黑菇毒素。毒蘑菇毒素致毒症状分为胃肠型、神经型、溶血型、肝脏损害型、呼吸与循环衰竭型和光过敏性皮炎型等6大中毒症状。
[0003]鹅膏肽类毒素是导致蘑菇中毒死亡的主要毒素，深受人们关注，对此发展出了诸多检测方法，包括显色法，色谱质谱法，免疫检测法等。但实际应用中还存在一些问题，显色法虽然简单快速但是灵敏度低，检测对象有限。免疫检测法简单且灵敏度高，但检测毒素种类少且只能定性，应用范围有限。色谱
‑
质谱法的效果最佳，不仅灵敏度高，检测对象广，还能定性定量。但是除了鹅膏肽类，还存在其他蘑菇毒素能够导致中毒，而目前用色谱
‑
质谱法对鹅膏肽类及其他蘑菇毒素同时检测的方法较少。
[0004]之前的研究表明，鹅膏肽类毒素常采用反相色谱法进行保留，而神经精神型蘑菇毒素多采用亲水作用进行保留。但部分神经精神型毒素极性差异较大，具备在反相色谱上保留的能力。同时T3色谱柱比传统C
18
增加了极性基团修饰，显著增强对极性分子的反相保留能力，因此存在将鹅膏肽类和神经精神型毒素同时保留在反相色谱上的实验基础。在前处理部分，我们考虑了色胺类蘑菇毒素容易形成阳离子化合物而鹅膏肽类毒素易被反相保留，故主要选取具有阳离子交换和非极性双重性的固相萃取小柱作为净化材料。最终，我们建立了一种能同时检测5种鹅膏肽类(3种鹅膏毒肽和2种鬼笔毒肽)、脱磷裸盖菇素和蟾蜍色胺的方法。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于克服发生蘑菇中毒时，蘑菇中含有多种类型毒素，常规检测方法无法覆盖检出的问题，提供一种快速有效检测食品中5种鹅膏肽类、脱磷裸盖菇素和蟾蜍色胺的定性定量检测方法。
[0006]一种5种鹅膏肽类、脱磷裸盖菇素和蟾蜍色胺的检测方法，包括如下步骤：
[0007](1)标准溶液的配制
[0008]将α
‑
鹅膏毒肽、β
‑
鹅膏毒肽、γ
‑
鹅膏毒肽、二羟鬼笔毒肽、羧基二羟鬼笔毒肽、脱磷裸盖菇素和蟾蜍色胺毒素标准品配制成标准储备液、使用液；将内标脱磷裸盖菇素
‑
d
10
、蟾蜍色胺
‑
d4配制成内标使用液。
[0009](2)标准曲线的制作
[0010]吸取上述标准使用液适量，用空白样品基质配制成系列浓度的标准工作液，经UPLC
‑
MS/MS分析，以5种鹅膏肽类毒素以定量离子峰面积为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准工作曲线，脱磷裸盖菇素与蟾蜍色胺以定量离子峰面积与对应内标的峰面积比值为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准工作曲线。
[0011](3)样品前处理
[0012]称取蘑菇干粉样品，进行前处理，得带测定的样品，其中，前处理的方法包括：
[0013]将蘑菇干粉用甲醇超声提取，旋蒸至干，复溶；用强阳离子交换固相萃取小柱净化后，氮气吹干、定容、涡旋混匀、离心取上清，得待测定的样品。
[0014](4)测定
[0015]a、色谱条件：
[0016]反相色谱柱：HSS T3 1.8μm,2.1
×
100mm或等效柱；柱温：40℃；进样体积：10μL；流动相A：含0.1％甲酸的5mmoL乙酸铵水溶液；流动相B：乙腈，梯度洗脱程序如下表1。
[0017]表1梯度洗脱程序
[0018][0019]b、质谱条件
[0020]离子源为电喷雾离子源，采用正离子模式，多离子反应监测，雾化气流量：3L/min；加热气流量：15L/min；接口温度：400℃；DL温度：250℃；加热块温度：400℃；干燥气流量：3L/min。α
‑
鹅膏毒肽等七种物质和2种内标的定性定量离子及碰撞能量见表2。
[0021]表2 7种蘑菇毒素及2种内标物监测的主要质谱参数
[0022][0023][0024]注：带*的为定量离子对
[0025]c、定量/定性测定。
[0026]进一步地，标准溶液的配制方法具体包括：
[0027]配制标准储备液：分别配制浓度为100μg/mL的α
‑
鹅膏毒肽、β
‑
鹅膏毒肽、γ
‑
鹅膏毒肽、二羟鬼笔毒肽、羧基二羟鬼笔毒肽、脱磷裸盖菇素的标准储备溶液和浓度为250μg/mL的蟾蜍色胺
‑
d4的标准储备溶液；
[0028]配制标准中间液：利用上述标准储备溶液分别配制浓度为10.0μg/mL的α
‑
鹅膏毒肽、β
‑
鹅膏毒肽、γ
‑
鹅膏毒肽、二羟鬼笔毒肽、羧基二羟鬼笔毒肽、脱磷裸盖菇素、蟾蜍色胺、脱磷裸盖菇素
‑
d
10
和蟾蜍色胺
‑
d4的标准中间溶液；
[0029]配制混合标准使用液：将上述α
‑
鹅膏毒肽、β
‑
鹅膏毒肽、γ
‑
鹅膏毒肽、二羟鬼笔毒肽、羧基二羟鬼笔毒肽、脱磷裸盖菇素和蟾蜍色胺标准中间溶液混合并定容，所有毒素的浓度均为1.00μg/mL，即为混合毒素标准使用溶液。将上述配制得到的脱磷裸盖菇素
‑
d
10
和蟾蜍色胺
‑
d4的标准中间溶液混合并定容，所有毒素的浓度均为1.00μg/mL，即为混合内标标准使用溶液。
[0030]进一步地，标准曲线的制作过程中，空白样品基质为不含所测蘑菇毒素的香菇样品，经上述样品前处理步骤处理后使用。
[0031]进一步地，在所述样品前处理过程中，净化材料采取强阳离子交换固相萃取小柱或混合型弱阳离子小柱、混合型阳离子萃取小柱等萃取柱，定容溶液为0.05％抗坏血酸水溶液。
[0032]进一步地，在步骤4)c中，所述定量测定具体包括：将前处理得到的待测定的样品注入UPLC
‑
MS/MS进行测定，测得样液中目标化合物的色谱峰面积，内标化合物的色谱峰面积，根据标准工作曲线，计算样品溶液中α
‑
鹅膏毒肽、β
‑
鹅膏毒肽、γ
‑
鹅膏毒肽、二羟鬼笔毒肽、羧基二羟鬼笔毒肽、脱磷裸盖菇素和蟾蜍色胺的浓度，再根据公式计算出样品中毒素的含量。
[0033]进一步地，在步骤4)c中，所述定性测定具体包括：前处理后得到的待本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测5种鹅膏肽类毒素、脱磷裸盖菇素和蟾蜍色胺的方法，其特征在于：包括如下步骤：（1）标准溶液的配制将α
‑
鹅膏毒肽、β
‑
鹅膏毒肽、γ
‑
鹅膏毒肽、二羟鬼笔毒肽、羧基二羟鬼笔毒肽、脱磷裸盖菇素和蟾蜍色胺毒素标准品配制成标准使用液；将脱磷裸盖菇素
‑
d
10
、蟾蜍色胺
‑
d4配制成标准使用液；（2）标准曲线的制作吸取上述标准使用液，用空白样品基质配制成系列浓度的标准工作液，经UPLC
‑
MS/MS分析，以5种鹅膏肽类毒素以定量离子峰面积为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准工作曲线，脱磷裸盖菇素与蟾蜍色胺以定量离子峰面积与对应内标峰面积比值为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准工作曲线；（3）样品前处理称取蘑菇干粉样品，进行前处理，得带测定的样品，其中，前处理的方法包括：将蘑菇干粉用甲醇超声提取，旋蒸至干，复溶；用强阳离子交换固相萃取小柱净化后，氮气吹干、定容、涡旋混匀、离心取上清，得待测定的样品；（4）测定a、色谱条件：T3反相色谱柱：HSS T3 1.8 μm, 2.1
×
100 mm或等效柱；柱温：40℃；进样体积：10 μL；流动相A：含0.1%甲酸的5 mmoL乙酸铵水溶液；流动相B：乙腈；洗脱程序为：时间（min）流动相A（%）流动相B（%）流速（mL/min）39550.3560400.365950.375950.37.59550.3109550.3b、质谱条件离子源为电喷雾离子源，采用正离子模式，多离子反应监测，雾化气流量：3 L/min；加热气流量：15 L/min；接口温度：400℃；DL温度：250℃；加热块温度：400℃；干燥气流量：3 L/min；c、定量/定性测定。2.根据权利要求1所述的一种检测5种鹅膏肽类毒素、脱磷裸盖菇素和蟾蜍色胺的方法，其特征在于：所述标准溶液的配制方法为：配制标准储备液：分别配制浓度为100 μg/mL的α
‑
鹅膏毒肽、β
‑
鹅膏毒肽、γ
‑
鹅膏毒肽、二羟鬼笔毒肽、羧基二羟鬼笔毒肽、脱磷裸盖菇素的标准储备溶液和浓度为250 μg/mL的蟾蜍色胺
‑
d4的标准储备溶液；配制标准中间液：利用所...

【专利技术属性】
技术研发人员：傅武胜，陈镜泽，方勤美，林仲，刘治燕，刘磊琦，
申请(专利权)人：福建省疾病预防控制中心福建省健康教育促进中心，福建省卫生检验检测中心，
类型：发明
国别省市：