一种检测血红蛋白类氧载体中碳酸酐酶的酶活性的方法技术

本发明专利技术提供一种检测血红蛋白类氧载体中碳酸酐酶的酶活性的方法，包括以下步骤：(1)向N个酶活性已知但不同的碳酸酐酶标准品中加入缓冲溶液、反应底物和酸碱指示剂，得到反应液n，建立反应液n的吸光度与反应时间的关系曲线，得到反应速率k，建立碳酸酐酶标准品的酶活性与反应速率k的标准工作曲线；其中，所述反应底物包含二氧化碳；(2)向待测样品中加入步骤(1)中的缓冲溶液、反应底物和酸碱指示剂，得到反应液n0，建立反应液n0的吸光度与反应时间的关系曲线，得到反应速率k0；(3)根据反应速率k0和标准工作曲线，得到待测样品中碳酸酐酶的酶活性。本方法操作简单、准确度高、对设备要求低且适用测量生物样品中碳酸酐酶的酶活性。且适用测量生物样品中碳酸酐酶的酶活性。

【技术实现步骤摘要】
一种检测血红蛋白类氧载体中碳酸酐酶的酶活性的方法


[0001]本专利技术涉及血红蛋白类氧载体
，具体涉及检测血红蛋白类氧载体中碳酸酐酶的酶活性的方法。

技术介绍

[0002]血红蛋白类氧载体(Hemoglobin
‑
Based Oxygen Carriers，HBOCs)是一种新兴的具有携氧功能的血液代用品，具有可长时间保存、无需配型、便于运输、感染风险低等优点，但其表现出良好治疗效果的同时也存在氧化应激、影响血管收缩、产生肾毒性损伤等毒副作用。有研究将血红蛋白与超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和碳酸酐酶(CA)复合来制备PolyHb
‑
SOD
‑
CAT
‑
CA，以解决上述问题。为进一步优化此类HBOCs产品的性能，对以上三种酶进行酶活性测定很有必要。其中碳酸酐酶(CA)广泛存在哺乳动物的组织中并参与机体多种生命活动，其作用主要使催化二氧化碳转化为碳酸、控制生物流体(如血液)的酸度。常见的CA的酶活测定方法有测压法、比色法、电极法和酯酶测定法等，但测压法操作繁琐，且测定误差较大，比色法使用的指示剂往往对酶的活性会存在影响，测定结果不够准确，电极法对设备要求较高，且测得的酶活的线性响应范围较小，酯酶测定法只能测定具有酯酶活性的碳酸酐酶的酶活。
[0003]因此，亟需一种操作简单、对设备要求低、测定结果准确且适用生物样品的碳酸酐酶的酶活性检测方法。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是提供一种操作简单、对设备要求低、适用生物样品的碳酸酐酶的酶活性检测方法，本专利技术的方法测定过程中酶活性不受生物样本和指示剂的影响，准确度高。
[0005]为达此目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0006]一种检测血红蛋白类氧载体中碳酸酐酶的酶活性的方法，包括以下步骤：
[0007](1)向N个酶活性已知但不同的碳酸酐酶标准品中加入缓冲溶液、反应底物和酸碱指示剂，得到反应液n，建立反应液n的吸光度与反应时间的关系曲线，得到反应速率k，建立碳酸酐酶标准品的酶活性与反应速率k的标准工作曲线；
[0008]其中，所述反应底物包含二氧化碳；
[0009](2)向待测样品中加入步骤(1)中的缓冲溶液、反应底物和酸碱指示剂，得到反应液n0，建立反应液n0的吸光度与反应时间的关系曲线，得到反应速率k0；
[0010](3)根据反应速率k0和标准工作曲线，得到待测样品中碳酸酐酶的酶活性。
[0011]根据本专利技术的一些实施方式，所述步骤(1)中待测样品为牛血或血红蛋白类氧载体原液稀释液。
[0012]根据本专利技术的一些实施方式，所述步骤(1)中缓冲溶液为Tris
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HCl缓冲溶液。
[0013]根据本专利技术的优选实施方式，所述步骤(1)中反应底物为二氧化碳饱和溶液。
[0014]根据本专利技术的优选实施方式，所述步骤(1)中酸碱指示剂为溴百里酚蓝。
[0015]根据本专利技术的优选实施方式，在25℃水浴下，向溴百里酚蓝水溶液中通入CO2气体，得到含溴百里酚蓝的CO2饱和溶液。
[0016]根据本专利技术的一些实施方式，所述步骤(1)中缓冲溶液的pH为6.50
‑
8.30，优选为7.60
‑
8.30。
[0017]根据本专利技术的一些实施方式，所述步骤(1)中缓冲溶液的浓度为0.01mol/L
‑
0.03mol/L，优选为0.015
‑
0.025mol/L。
[0018]根据本专利技术的一些实施方式，所述步骤(1)中酸碱指示剂的浓度为0.01g/L
‑
0.03g/L，优选为0.012g/L
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0.02g/L。
[0019]根据本专利技术的一些实施方式，所述步骤(1)和步骤(2)中使用紫外
‑
可见光分光光度计在速率模式下测量吸光度值。
[0020]根据本专利技术的一些实施方式，所述步骤(1)和步骤(2)中在同一波长下测量吸光度值。
[0021]根据本专利技术的一些实施方式，所述吸光度的测量波长为570nm
‑
650nm，优选为600nm
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630nm，更优选为610nm
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630nm，最优选为617nm。
[0022]根据本专利技术的一些实施方式，所述步骤(1)中N为不小于3的正整数，优选为5
‑
10之间的正整数，例如5，6，7，8，9或10。
[0023]根据本专利技术的一些实施方式，所述步骤(1)中碳酸酐酶标准品的酶活性为0U/mL
‑
200U/mL，优选为0U/mL
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100U/mL，例如碳酸酐酶标准品的酶活性为100U/mL、75U/mL、50U/mL、25U/mL、12.5U/mL、0U/mL。
[0024]根据本专利技术的一些实施方式，所述步骤(2)中，待测样品为使用pH为7.35
‑
7.45的磷酸钾盐缓冲溶液稀释40
‑
60倍后的牛血。
[0025]根据本专利技术的一些实施方式，所述步骤(2)中，待测样品为使用pH为7.35
‑
7.45的磷酸钾盐缓冲溶液稀释15
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30倍后的血红蛋白类氧载体原液。
[0026]根据本专利技术的一些实施方式，所述步骤(1)中以反应时间T(s)为横坐标，吸光度值A为纵坐标作图，所得直线的斜率为反应速率k。
[0027]根据本专利技术的一些实施方式，所述步骤(2)中以反应时间T(s)为横坐标，吸光度值A为纵坐标作图，所得直线的斜率为反应速率k0。
[0028]根据本专利技术的一些实施方式，所述步骤(1)中以反应速率为横坐标，CA标准品的酶活性为纵坐标作图，建立碳酸酐酶标准品的酶活性与反应速率k的标准工作曲线。
[0029]根据本专利技术的一些实施方式，所述步骤(2)中选取反应时间为0s
‑
16s，优选为2s
‑
6s处的吸光度值作图。
[0030]与现有技术相比，本专利技术具有如下优点：本专利技术选择特定的酸碱指示剂和特定pH的缓冲溶液，使CA催化二氧化碳水合反应的反应速率与其在某一波长处的吸光度值变化成呈线性关系，并通过建立CA酶活性的标准工作曲线，实现对血红蛋白类氧载体中CA酶活性的准确测定，且操作简单、对设备要求低、测定过程中酶活性不受生物样本和指示剂的影响。
附图说明
[0031]图1为实施例2中进行全波长扫描的光谱图。
[0032]图2为实施例3中建立的CA酶的酶活性标准工作曲线图。
具体实施方式
[0033]为使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本专利技术进行进一步的详细说明。此处所描述的具体实施例仅用于解释本专利技术，并不用于构成对本专利技术的任何限制。
[0034]除非另有定义，否则本本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测血红蛋白类氧载体中碳酸酐酶的酶活性的方法，包括以下步骤：(1)向N个酶活性已知但不同的碳酸酐酶标准品中加入缓冲溶液、反应底物和酸碱指示剂，得到反应液n，建立反应液n的吸光度与反应时间的关系曲线，得到反应速率k，建立碳酸酐酶标准品的酶活性与反应速率k的标准工作曲线；其中，所述反应底物包含二氧化碳；(2)向待测样品中加入步骤(1)中的缓冲溶液、反应底物和酸碱指示剂，得到反应液n0，建立反应液n0的吸光度与反应时间的关系曲线，得到反应速率k0；(3)根据反应速率k0和标准工作曲线，得到待测样品中碳酸酐酶的酶活性。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)中待测样品为牛血或血红蛋白类氧载体原液稀释液；和/或步骤(1)中缓冲溶液为Tris
‑
HCl缓冲溶液；和/或步骤(1)中反应底物为二氧化碳饱和溶液；和/或步骤(1)中酸碱指示剂为溴百里酚蓝。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤(1)中缓冲溶液的pH为6.50
‑
8.30，优选为7.60
‑
8.30；和/或步骤(1)中缓冲溶液的浓度为0.01mol/L
‑
0.03mol/L，优选为0.015
‑
0.025mol/L。4.根据权利要求1
‑
3任意一项所述的方法，其特征在于：步骤(1)中酸碱指示剂的浓度为0.01g/L
‑
0.03g/L，优选为0.012g/L
‑
0.02g/L。5.根据权利要求1
‑
4任意一项所述的方法，其特征在于：在波长570nm
‑
650nm，优选为600nm
...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈刚，蔡伟江，邓蓉琪，夏烈文，郑春辉，万章，莫德欢，王瑶曦，
申请(专利权)人：云锦华彰北京生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：