本发明专利技术公开了一种水稻尿嘧啶DNA糖苷酶及其在基因编辑诱导植物单碱基多样性中的应用。该水稻尿嘧啶DNA糖苷酶，是由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白；或将SEQ IDNO.2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加由SEQ ID NO.2衍生的且保持SEQ ID NO.2所示的蛋白功能的蛋白。本发明专利技术提供的应用，是将含有所述水稻尿嘧啶DNA糖苷酶UNG的生物材料，构建为包含该OsUNG序列的植物胞嘧啶单碱基编辑载体OsCGBE，并将该表达载体导入植物中，诱导DNA上的C碱基突变成T或G或A，高效的创制出植物单碱基多样性，扩大了单碱基编辑器的适用范围。编辑器的适用范围。编辑器的适用范围。
【技术实现步骤摘要】
水稻尿嘧啶DNA糖苷酶及其在基因编辑诱导植物单碱基多样性中的应用
[0001]本专利技术涉及生物技术和植物基因工程
，具体涉及一种水稻尿嘧啶DNA糖苷酶及其在基因编辑诱导植物单碱基多样性中的应用。
技术介绍
[0002]近年发展起来的人工核酸酶可通过引起特定位点的DNA双链断裂实现对目的片段的有效编辑。碱基编辑器，目前包括胞苷碱基编辑器(cytidine base editor，CBE)和腺嘌呤碱基编辑器(Adenine base editor,ABE)，能够在基因组中进行精确的碱基改变而不诱发DNA双链断裂(DSBs)。植物的许多农艺性状是由一个或几个DNA碱基的变化控制的，因此碱基编辑器是植物分子育种的重要工具。
[0003]现有的单碱基编辑器CBE和ABE系统，由大鼠胞苷脱氨酶APOBEC1(rAPOBEC1)，激活诱导的胞苷脱氨酶(AID)PmCDA1，或进化的tRNA腺嘌呤脱氨酶TadA，与Cas9切口酶(Cas9 nikase,nCas9)或无核酸酶活性的Cas9(nuclease dead Cas9,dCas9)融合，并通过sgRNA(单链向导RNA)将融合蛋白靶向靶位点，在不切割双链DNA的情况下对靶基因位点的单个碱基进行胞嘧啶C
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>胸腺嘧啶T或腺嘌呤A
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>鸟嘌呤G的精准编辑，已被应用于许多植物物种。
[0004]单碱基变异(SNP)是植物基因组上最常见的突变类型，与众多农艺性状关联。通过对这些特定SNP进行突变，不仅可实现定向遗传改良，而且可拓展遗传多样性，加快育种进程。碱基编辑器是一种高效单碱基替换工具，主要包括诱导胞嘧啶C
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>胸腺嘧啶T替换的CBE和诱导腺嘌呤A
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>鸟嘌呤G替换的ABE。目前，传统的植物基因胞嘧啶单碱基编辑系统，主要是诱导胞嘧啶C
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>胸腺嘧啶T的单碱基定点替换，而由于胞嘧啶C
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>鸟嘌呤G或胞嘧啶C
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>腺嘌呤A定点替换效率很低，同时可替换的碱基类型比较有限，大大限制了单碱基编辑器的适用范围。
技术实现思路
[0005]针对现有技术的上述不足，本专利技术提供一种水稻尿嘧啶DNA糖苷酶及其在基因编辑诱导植物单碱基多样性中的应用，通过水稻尿嘧啶DNA糖苷酶构建包含该OsUNG序列的植物胞嘧啶单碱基编辑载体(OsCGBE)，将该表达载体导入植物中，以高效诱导DNA上的C碱基突变成T或G或A，实现高效创制植物的单碱基多样性。
[0006]本专利技术为实现上述目的，提供如下的技术方案：
[0007]一种水稻尿嘧啶DNA糖苷酶，其特征在于，该水稻尿嘧啶DNA糖苷酶OsUNG，是由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白；或
[0008]将SEQ ID NO.2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加由SEQ ID NO.2衍生的且保持SEQ ID NO.2所示的蛋白功能的蛋白。
[0009]所述水稻尿嘧啶DNA糖苷酶UNG的编码基因具有：
[0010]A、SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，或
[0011]B、在SEQ ID No.1所示的核苷酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个核苷酸且具有同等功能的由1)衍生的核苷酸序列；或
[0012]C、在设定下与SEQ ID NO:1所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列，所述设定为在含0.1％SDS的0.1X SSPE或含0.1％SDS的0.1X SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或
[0013]D、与A或B或C的核苷酸序列具有90％以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。
[0014]另一种所述的水稻尿嘧啶DNA糖苷酶的氨基酸序列为：
[0015]由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白；或
[0016]将SEQ ID NO.2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加由SEQ ID NO.2衍生的且保持SEQ ID NO.2所示的蛋白功能的蛋白。
[0017]所述水稻尿嘧啶DNA糖苷酶UNG的编码基因，具有：
[0018]E、SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，或
[0019]F、在SEQ ID No.1所示的核苷酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个核苷酸且具有同等功能的由E衍生的核苷酸序列；或
[0020]G、在设定下与SEQ ID NO:1所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列，所述设定为在含0.1％SDS的0.1X SSPE或含0.1％SDS的0.1X SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或
[0021]H、与E或F或G的核苷酸序列具有90％以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。
[0022]一种水稻尿嘧啶DNA糖苷酶UNG在诱导植物单碱基多样性的应用，其是将含有前述水稻尿嘧啶DNA糖苷酶UNG的生物材料，构建为包含该OsUNG序列的植物胞嘧啶单碱基编辑载体OsCGBE，并将该表达载体导入植物中，诱导DNA上的C碱基突变成T或G或A，以高效的创制出植物单碱基多样性。
[0023]本专利技术提供的水稻尿嘧啶DNA糖苷酶及其在基因编辑诱导植物单碱基多样性中的应用，其有益效果为：
[0024]1、本专利技术将水稻内源的尿嘧啶DNA糖苷酶(OsUNG)融合在胞嘧啶单碱基编辑器的C端，使胞嘧啶C脱氨后形成的尿嘧啶U被高效脱糖苷，形成无嘌呤/嘧啶位点，在细胞内源修复过程中产生胞嘧啶C
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>鸟嘌呤G替换或胞嘧啶C
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>腺嘌呤A替换的突变类型，显著扩大了单碱基编辑器的适用范围。
[0025]2、在本专利技术利用水稻内源的尿嘧啶DNA糖苷酶(OsUNG)构建的胞嘧啶单碱基编辑器(OsCGBE)，产生的胞嘧啶C
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>鸟嘌呤G或胞嘧啶C
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>腺嘌呤A替换效率是传统的植物胞嘧啶单碱基编辑器(PCBE4)的20.3倍。在稳定转化的水稻材料中，可以产生高达30.5％的胞嘧啶C
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>鸟嘌呤G的突变，32.2％胞嘧啶C
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>胸腺嘧啶T的突变类型，以及3.4％的胞嘧啶C
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>腺嘌呤A的突变类型，极大的拓展了水稻单碱基编辑可产生的突变类型，对于拓展作物遗传多样性具有重要的意义。
附图说明
[0026]图1是本专利技术实施例使用OsUNG构建的新型胞嘧啶单碱基编辑器示意图；
[0027]图2是本专利技术实施例将避光培养的细胞进行离心，裂解后的编辑结果检测示意图；
[0028]图3是本专利技术实施例对分化再生的水稻植株进行基因型鉴定结果示意图；
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【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种水稻尿嘧啶DNA糖苷酶，其特征在于，该水稻尿嘧啶DNA糖苷酶OsUNG，是由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白；或将SEQ ID NO.2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加由SEQ ID NO.2衍生的且保持SEQ ID NO.2所示的蛋白功能的蛋白。2.根据权利要求1所述的水稻尿嘧啶DNA糖苷酶，其特征在于，所述水稻尿嘧啶DNA糖苷酶UNG的编码基因具有：A、SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，或B、在SEQ ID No.1所示的核苷酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个核苷酸且具有同等功能的由A衍生的核苷酸序列；或C、在设定下与SEQ ID NO:1所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列，所述设定为在含0.1％SDS的0.1X SSPE或含0.1％SDS的0.1X SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或D、与A或B或C的核苷酸序列具有90％以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。3.根据权利要求1所述的水稻尿嘧啶DNA糖苷酶，其特征在于,所述的水稻尿嘧啶DNA糖苷酶的氨基酸序列为：由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白；或将SEQ ID NO.2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加由SEQ ID NO.2衍生的且保持SEQ ID NO.2所示的蛋白功能的蛋白。4.根据权利要求3所述的水稻尿嘧啶DNA糖苷酶，其特征在于，所述水稻尿嘧啶DNA糖苷酶UNG的编码基因，具有：E、SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，或F、在SEQ ID No.1所示的核苷酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个核苷酸且具有同等功能的由E衍生的核苷酸序列；或G、在设定下与SEQ ID NO:1所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列，所述设定为在含0.1％SDS的0.1X SSPE或含0.1％SDS的0.1X SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或H、与E或F或G的核苷酸序列具有90％以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。5.一种水稻尿嘧啶DNA糖苷酶UNG在诱导植物单碱基多样性的应用，其是将含有权利要求1
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4任一项所述水稻尿嘧啶DNA糖苷酶UNG的生物材料，构建为包含该OsUNG序列的植物胞嘧啶单碱基编辑载体OsCGBE，并将该表达载体导入植物中，诱导DNA上的C碱基突变成T或G或A，以高效的创制...
【专利技术属性】
技术研发人员：朱健康，陆钰明，田益夫，沈润东，
申请(专利权)人：中国科学院分子植物科学卓越创新中心，
类型：发明
国别省市：
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