一种季也蒙念珠菌外切β-1,3-葡聚糖酶及其突变体及应用制造技术

本发明专利技术属于生物工程技术领域，具体涉及一种季也蒙念珠菌外切β

【技术实现步骤摘要】
一种季也蒙念珠菌外切
β
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1,3
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葡聚糖酶及其突变体及应用


[0001]本专利技术属于生物工程
，具体涉及一种季也蒙念珠菌外切β
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1,3
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葡聚糖酶及其突变体及应用。

技术介绍

[0002]天然产物在当今的药物治疗中发挥着重要作用，临床中使用的大量药物要么是天然的，要么是从植物中提取的。中国有许多“极其有效”的水果。因此，这些来源可能有助于开发更安全、更可接受的药物。
[0003]罗汉果(Siraitia grosvenorii)是广西道地药材，对生境的要求较严格，主要垂直分布于海拔250～1000m的亚热带有坡地区，要求生长在昼夜温差较大、环境湿润的地区；喜光但不耐强光，怕霜冻；适宜栽培在排水较好、有机质丰富、疏松湿润的红黄壤土中。300多年来，罗汉果一直被用作天然甜味剂，在中国被用作治疗咽炎、咽痛和止咳的传统药物。是中国首批批准的药食同源物种之一。是中国首批批准的药食同源物种之一(“药食同源”的概念在《黄帝内经》中有提及)。作为一种极具开发潜力的天然产物，已被广泛研究。从该植物中分离出三萜、类黄酮和氨基酸等化合物。罗汉果及其活性成分具有广泛的药理作用，如抗氧化、降糖、免疫、抗咳痰、保肝、抗菌等【Gong,Xue,et al.Frontiers in pharmacology(2019):1400.】1。目前，以罗汉果为主要原料已经制成的中药有罗汉果咽喉片、镇咳祛痰合剂、罗汉果止咳露、止咳定喘片、罗汉果止咳剂等(黎霜等，2003)。罗汉果甜苷类物质甜度高、热值低、水溶性与热稳定性好。无毒，食用安全，没有异味，因此广泛应用于食品及保健品工业中。近年来，罗汉果被制成汁粉、果糕、柿饼汤、面包、果凉茶、单晶冰糖等食品和保健品；罗汉果在国外市场也非常受欢迎，日本、韩国、英国、新加坡等国先后批准罗汉果可以作为食品添加剂，特别是用罗汉果制成的高级润喉糖、罗汉果果汁等产品在日本深受人们的喜爱。
[0004]西葫芦苷是罗汉果的主要成分，也是罗汉果的有效成分。自1983年Takemoto 等从罗汉果中分离出mogrosides IV、V和VI(Takemoto T,.Yakugaku zasshi:Journal ofthe Pharmaceutical Society of Japan,1983,103(11):1167
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1173.)2以来，已从罗汉果中分离出30多种类似化合物(Jia,Zhonghua,.Natural Product Communications 4.6(2009): 1934578X0900400606)3。在新鲜水果中，罗汉果糖苷含量为1.19％；而在干果中，罗汉果糖苷含量为可达3.82％(Li H B,et al.Food Sci,2006,27(6):171
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173.)4.罗汉果苷V是罗汉果中主要糖苷，干果中占比0.5
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1.4％(Hai
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Bin L I,et al.Food Science, 2006.)5.罗汉果苷大多具有味甜，统称为罗汉果苷，是罗汉果的主要活性成分。其中,罗汉果苷IV、V和赛门苷I是迄今为止报道的罗汉果甜苷中甜度最高的3种成分，分别为蔗糖甜度的392，425和563倍。赛门苷I是葫芦烷三萜苷中最甜的成分，赛门苷I(0.01％浓度)的为5％蔗糖甜度的563倍(Matsumoto K,et al.Chemical&PharmaceuticalBulletin,2008,38(7):2030
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2032.)6此外，体外试验表明赛门苷I对麦芽糖酶有抑制作用，Suzuki等研究发现，罗汉果苷V，IV，III，赛门苷I对单剂量口服麦芽糖大鼠餐后血糖具有强烈的抑制作用，IC
50
分别为14,
12,10和1.6mM(Suzuki Y A,et al.Journal of agriculturaland food chemistry,2005,53(8):2941
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2946.)7。
[0005][0006]在过去的几十年里，全球对天然甜味剂的需求显著增加，原因是人们对人工甜味剂作为糖替代品的长期消费感到担忧。到目前为止，美国食品和药物管理局只批准了两种高强度天然甜味剂，包括纯化的莱鲍迪苷A(甜菊叶提取物)和罗汉果提取物(从罗汉果的果实提取，通常称为罗汉果:LHK)(FDA,2008,2010)。事实上，赛门苷I目前被认为是最甜的罗汉果苷。此外，据报道，赛门苷I的味道优于罗汉果苷IV和罗汉果苷V(Zhou等，2014)；然而，天然甜果苷提取物中赛门苷I的含量有限(Matsumoto等，1990)。因此，采用分离、纯化或富集的方法获得高浓度的天然赛门苷I将是有益的。人们已经进行了许多尝试，包括化学水解、植物组织培、酶处理和微生物发酵，将罗汉果苷V转化为赛门苷I。不幸的是，罗汉果苷V 中葡萄糖分支侧链的复杂性使得生产或分离纯赛门苷I极具挑战性。当前赛门苷I的生产与制备主要是通过植物提取获得，但是植物类含量极低，严重制约着赛门苷I的大规模应用。
[0007]本实验室前期从罗汉果内生菌中筛选到一株季也蒙念珠菌Meyerozyma guilliermondii，该菌株的名称为Meyerozyma guilliermondii LHGNSJ
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VS01(M.guilliermondii LHGNSJ
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VS01) (参见专利CN201910266094.X)。对该菌株发酵获得粗胞外蛋白(蛋白混合物)，专利技术人发现粗蛋白具有所述的胞外蛋白将罗汉果苷V转化为赛门苷I的作用。但由于粗蛋白提取物并不知道具体哪些蛋白起作用。本专利技术在该专利基础上做了进一步研究。经分离纯化，纯化所得蛋白进行鉴定，获得全新的单一功能蛋白，经文献检索确定为外切β
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1,3
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葡聚糖酶。该酶未见催化罗汉果苷V转化为赛门苷I的报道。

技术实现思路

[0008]本专利技术的目的之一：提供一种全新的来自于季也蒙念珠菌的外切β
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1,3
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葡聚糖酶Exo15，并发发现催化合成赛门苷I的作用；
[0009]本专利技术的目的之二：为提供提高重组蛋白Exo15可溶性，通过迭代饱和突变提高重组蛋白Exo15催化活性，提供外切β
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1,3
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葡聚糖酶的突变体Exo15的突变体，该突变体具有更高效制备赛门苷I的催化作用。
[0010]技术方案
[0011]一种外切β
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1,3
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葡聚糖酶Exo15在制备将罗汉果苷V转化为赛门苷I的催化剂的应用，其特征在于所述的外切β
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1,3
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葡聚糖酶Exo15的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种外切β
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1,3
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葡聚糖酶Exo15，其特征在于所述的外切β
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葡聚糖酶Exo15的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。2.一种外切β
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葡聚糖酶Exo15的突变体，其特征在于所述突变体相对于季也蒙念珠菌外切β
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葡聚糖酶亲本，将将第266位氨基酸残基突变为酪氨酸，或第261位氨基酸残基突变为酪氨酸的同时将第289位突变为精氨酸。3.根据权利要求2所述的突变体，其特征在于其核苷酸序列为SEQ ID NO：3或5所示；其氨基酸序列为SEQ ID NO：4或6所示。4.一种表达质粒，其特征在于，所述的的表达质粒含有权利要求1所述的外切β
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1,3
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葡聚糖酶Exo15或含有权利要求2或3所述的突变体。5.一种重组菌株，其特征在于，含有权利要求4所述的表达质粒。6.根...

【专利技术属性】
技术研发人员：王鸿江，钟艾玲，谢海峰，谢期林，
申请(专利权)人：成都普睿法药物研发有限公司，
类型：发明
国别省市：