一种利用间接竞争ELISA高通量快速筛查多种内分泌干扰物的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用间接竞争ELISA高通量快速筛查多种内分泌干扰物的方法。本发明专利技术提供的方法，包括如下步骤：采用多孔板通过间接竞争ELISA检测双酚A、雌二醇和壬基酚；多孔板中，部分孔用于检测双酚A、部分孔用于检测雌二醇、部分孔用于检测壬基酚；作为包被原的双酚A抗原的包被浓度为0.18

【技术实现步骤摘要】
一种利用间接竞争ELISA高通量快速筛查多种内分泌干扰物的方法


[0001]本专利技术涉及一种利用间接竞争ELISA高通量快速筛查多种内分泌干扰物的方法。

技术介绍

[0002]内分泌干扰物(EDCs)是指环境中存在的能干扰人类或动物内分泌系统的化学物质。内分泌干扰物在生产生活中广泛存在，大部分内分泌干扰物具有脂溶性和疏水性，且化学性质较稳定，容易在土壤或沉积物中吸附，同时其半衰期较长，在环境中存在的内分泌干扰物很难被降解和去除。内分泌干扰物除了干扰生物体的内分泌功能之外，还可能导致生物体发育异常、代谢紊乱以及其他病理性损伤，影响人类和其他动物的繁殖，严重时甚至会破坏生态平衡。
[0003]双酚A是用途最广泛的合成内分泌干扰物之一，一般用于塑料容器的生产过程中，如塑料杯、塑料奶瓶等。双酚A可以结合并刺激雌激素受体，改变人体各组织中雌激素受体的密度，能干扰类固醇激素(如睾酮、甲状腺激素)发挥作用。双酚A能模拟生物体内的雌激素，即使很少量的双酚A也有导致动物性早熟、精子数减少、前列腺增长等作用，是目前研究最多且最为大众熟知的内分泌干扰物之一。
[0004]雌二醇一般用于畜禽养殖业，雌二醇和其衍生物存在于肉、蛋、乳制品中，通过食物链在人体内积累，导致儿童性发育异常，而且有损害人体的肝、肾等器官的风险。目前，一些国家已经禁止在畜牧业中使用雌二醇，我国农业部规定雌二醇只能用作治疗，但在动物性食品中不得检出。
[0005]壬基酚在工业生产中使用广泛，常用于生产洗涤剂、柔顺剂、润滑油添加剂、塑料产品以及工业橡胶制品等。壬基酚通常由皮肤接触和饮食等方式进入人体，蓄积的壬基酚会对人体的内分泌系统和生殖系统造成影响，导致生殖系统发育异常、癌症等健康风险。
[0006]酶联免疫吸附法(Enzyme
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Linked Immunosorbent Assay,ELISA)是一种基于抗原
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抗体特异性反应的免疫检测技术，具有快速、灵敏、成本低等优点，这种方法操作简便，检测前无需对样品进行复杂的前处理，且能同时分析大量样品。直接法将抗原包被在固相载体上，加入酶标记的抗体反应完全后，加入酶的底物显色，根据显色情况确定待测抗原的量；该方法要求抗体具有较强的特异性，而且测定前需要提前对抗体进行酶标记，这使得检测过程复杂化，并且并非所有的抗体都适合用酶标记，因此直接法的应用受到了限制。间接法将抗原包被在固相载体上，加入抗体充分反应，然后加入酶标记的二级抗体反应，反应完全后加入底物显色，该方法与直接法相比具有一定优势，不仅能增强信号，而且省去了酶标记一级抗体的过程，避免因该过程使一抗活性降低。夹心法是将包被一抗固定在载体表面，再加入含有待测抗原的样品反应一定时间，然后加入酶标二抗，反应完全后加入底物显色，根据显色情况确定待测抗原的量；该方法待测抗原夹在一抗与二抗之间，要求抗原至少有两个能与抗体结合的位点，同时这两种抗体之间不能存在交叉反应或竞争抗原的相同结合点位。竞争法是将抗原包被在固相载体上，加入样品(含待测抗原)和酶标一抗，样品中的抗
原与固相载体表面的抗原竞争抗体，样品中的抗原越多，结合的抗体越多，则固相载体表面的抗原结合的抗体越少，反之同理，然后加入底物显色，根据显色程度确定剩余抗体量，从而就能得到待测抗原量。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的是提供一种利用间接竞争ELISA高通量快速筛查多种内分泌干扰物的方法。
[0008]本专利技术提供了一种检测双酚A的方法，包括如下步骤：
[0009]采用间接竞争ELISA检测双酚A；
[0010]作为包被原的双酚A抗原的包被浓度为0.18
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0.2μg/mL；作为一抗的双酚A抗体的工作浓度为0.8
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1μg/mL。
[0011]具体的，作为包被原的双酚A抗原的包被浓度为0.19μg/mL。
[0012]具体的，作为一抗的双酚A抗体的工作浓度为0.9μg/mL。
[0013]本专利技术提供的检测双酚A的方法，具体包括如下步骤：
[0014](1)包被抗原：取96孔板，每孔加入100μL抗原稀释液，密封，4℃过夜；
[0015]将双酚A完全抗原用PBS缓冲液溶解，得到浓度为1.69mg/mL的母液，然后用包被液稀释至9000倍体积，即为抗原稀释液；
[0016](2)洗涤：将96孔板内的液体甩出，重复清洗三次(每次均为：每孔加入200μL PBST溶液震荡后倒掉，然后拍干)；
[0017](3)封闭：每孔加入150μL含5mg/mL BSA的PBS缓冲液，密封，37℃封闭2h；
[0018](4)洗涤：弃除96孔板内的液体，重复清洗三次(每次均为：每孔加入200μL PBST溶液震荡后倒掉，然后拍干)；
[0019](5)每孔加入50μL样本、50μL抗体稀释液和50μL二抗工作液，用保鲜膜密封，37℃反应120min；
[0020]样本为双酚A标准品溶液或供试样本液；
[0021]将双酚A标准品用PBS缓冲液溶解并稀释，得到浓度分别为200、100、50、25、12.5和6.25μg/L的稀释液，即为双酚A标准品溶液；
[0022]将双酚A抗体用PBS缓冲液溶解，得到浓度为2.59mg/mL的母液，然后用PBS缓冲液稀释至3000倍体积，即为抗体稀释液；
[0023]酶标二抗用PBS缓冲液稀释至500倍体积，即为二抗工作液；
[0024](6)洗涤：将96孔板内的液体甩出，重复清洗五次(每次均为：每孔加入200μL PBST溶液震荡后倒掉，然后拍干)；
[0025](7)显色：将TMB双组份显色液的A液和B液等比例充分混合，每孔加入100μL该混合液，当阴性对照的孔变为亮蓝色后(约3
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5min)时，每孔加入50μL终止液终止显色；
[0026](8)测量：将96孔板放在酶标仪中，测量各孔450nm波长下的吸光度值；
[0027]用双酚A标准品溶液制作以双酚A浓度为自变量以吸光度值为因变量的标准曲线；根据标准曲线以及供试样本液的吸光值计算供试样本液的双酚A浓度。
[0028]本专利技术提供了一种检测雌二醇的方法，包括如下步骤：
[0029]采用间接竞争ELISA检测雌二醇；
[0030]作为包被原的雌二醇抗原的包被浓度为3.1
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3.2μg/mL；作为一抗的雌二醇抗体的工作浓度为9
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10μg/mL。
[0031]具体的，作为包被原的雌二醇抗原的包被浓度为3.17μg/mL。
[0032]具体的，作为一抗的雌二醇抗体的工作浓度为9.5μg/mL。
[0033]本专利技术提供的检测雌二醇的方法，具体包括如下步骤：
[0034](1)包被抗原：取96孔板，每孔加入100μL抗原稀释液，密封，4℃过夜；
[0035]将雌二醇完全抗原用PBS缓冲液溶解，得到浓度为9本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测双酚A的方法，包括如下步骤：采用间接竞争ELISA检测双酚A；作为包被原的双酚A抗原的包被浓度为0.18
‑
0.2μg/mL；作为一抗的双酚A抗体的工作浓度为0.8
‑
1μg/mL。2.一种检测雌二醇的方法，包括如下步骤：采用间接竞争ELISA检测雌二醇；作为包被原的雌二醇抗原的包被浓度为3.1
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3.2μg/mL；作为一抗的雌二醇抗体的工作浓度为9
‑
10μg/mL。3.一种检测壬基酚的方法，包括如下步骤：采用间接竞争ELISA检测双酚A；作为包被原的壬基酚抗原的包被浓度为0.3
‑
0.4μg/mL；作为一抗的壬基酚抗体的工作浓度为2
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3μg/mL。4.一种同时检测双酚A、雌二醇和壬基酚的方法，包括如下步骤：采用多孔板通过间接竞争ELISA检测双酚A、雌二醇和壬基酚；多孔板中，部分孔用于检测双酚A、部分孔用于检测雌二醇、部分孔用于检测壬基酚；检测双酚A时，作为包被原的双酚A抗原的包被浓度为0.18
‑
0.2μg/mL；作为一抗的双酚A抗体的工作浓度为0.8
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1μg/mL；检测雌二醇时，作为包被原的雌二醇抗原的包被浓度为3.1
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3.2μg/mL；作为一抗的雌二醇抗体的工作浓度为9
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10μg/mL；检测壬基酚时，作为包被原的壬基酚抗原的包被浓度为0.3
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0.4μg/mL；作为一抗的壬基酚抗体的工作浓度为2
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3μg/mL。5.一种同时检测雌二醇和壬基酚的方法，包括如下步骤：采用多孔板通过间接竞争ELISA检测雌二醇和壬基酚；多孔板中，部分孔用于检测雌二醇、部分孔用于检测壬基酚；检测雌二醇时，作为包被原的雌二醇抗原的包被浓度为3.1
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3.2μg/mL；作为一抗的雌二醇抗体的工作浓度为9
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10μg/mL；检测壬基酚时，作为包被原的壬基酚抗原的包被浓度为0.3
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0.4μg/mL；作为一抗的壬基酚抗体的工作浓度为2
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【专利技术属性】
技术研发人员：张天牧，李奕君，何苗，
申请(专利权)人：清华大学，
类型：发明
国别省市：