一种基于96孔板固载分子马达的传感器检测试剂盒、及其用于P24抗原体外检测的方法技术

本发明专利技术公开了一种基于96孔板固载分子马达的传感器检测试剂盒、及其用于P24抗原体外检测的方法，试剂盒由一块分子马达传感器检测板构成，该检测板由F0F1

A sensor detection kit based on 96 well plate immobilized molecular motor and its method for in vitro detection of p24 antigen

【技术实现步骤摘要】
一种基于96孔板固载分子马达的传感器检测试剂盒、及其用于P24抗原体外检测的方法


[0001]本专利技术属于体外诊断试剂领域，具体涉及一种基于96孔板固载分子马达的传感器检测试剂盒、及其用于P24抗原体外检测的方法。

技术介绍

[0002]生物分子马达是将化学能转化为机械能的蛋白酶，其中ATP合酶又称F0F1
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ATP合酶(F0F1
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ATPase)，广泛的存在于动物和真菌的线粒体内膜、植物叶绿体类囊体膜及细菌质膜中，是ATP合成的主要场所，是目前已知最小的旋转分子马达。F0F1
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ATP合酶既能利用跨膜质子梯度合成ATP，驱动转子顺时针旋转，又能水解ATP转运质子，驱动转子逆时针旋转。由于F0F1
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ATPase特殊的运动旋转特性，利用其化学能和机械能的转换机制可以将其制备成分子马达生物传感器。其检测原理是利用连接在转子上的探针与分析物结合影响转子转速，从而影响ATP酶活性，通过合成活性反应检测目标浓度。
[0003]传统分子马达生物传感器检测试剂盒，往往是将分子马达固定于磁珠表面构建生物传感器，但该改建方法依赖于生物素
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链霉亲和素
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生物系统进行磁珠与分子马达的连接，容易产生磁珠
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磁珠的无效副产物。由于磁珠容易沉降，所以检测时批间差异大，且磁珠化分子马达生物传感器在大规模检测时，操作繁琐复杂且重复性高。故本专利技术将分子马达固载于96孔板内构建生物传感器，96孔板作为固载底板保证了分子马达起始信号的固定性，避免了磁珠化生物传感器的批间差异问题，同时，一块板可实现同时检测百个样品，适用于大规模筛选检测。

技术实现思路

[0004]为了解决现有磁珠化分子马达生物传感器的不足，避免磁珠化分子马达生物传感器检测时的批间差异，提高检测信号的稳定性，并满足大规模快速检测筛选的需要，本专利技术设计开发了一种新型分子马达生物传感器检测试剂盒，本专利技术首先构建了一种可长期保存的分子马达检测板，再以特异性P24抗体为检测探针构建传感器。本专利技术利用96孔板固载分子马达的稳定性、均一性以及多孔性，实现在一定范围内对目标P24抗原进行定量检测，提高了检测灵敏度，特异性和稳定性。96孔板作为检测板的背衬板，可以实现同时检测近百个样品的需求，大大减少了检测时间，适用进行高通量检测筛选。
[0005]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：所述的一种基于96孔板固载分子马达的传感器检测试剂盒，其特征在于试剂盒由一块分子马达传感器检测板构成，该检测板由F0F1
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ATP酶分子马达固载于96孔酶标板形成，同时结合检测探针形成分子马达生物传感器用于捕获靶标，该试剂盒的制备包括以下步骤：1）生物素化分子马达制备：采用生物素化磷脂，在超声条件下与分子马达在溶剂中混合，使生物素化磷脂的
亲脂端插入分子马达脂质囊泡的磷脂双分子层中，形成生物素化的分子马达；所述生物素化磷脂为16:0 Biotinyl PE、18:1
‑
12:0 Biotin PE或18:0 Biotinyl PE；2）检测板制备：
①
用链霉亲和素包被96孔酶标板，并用BSA溶液封闭；所述链霉亲和素浓度0.01~1 mg/L所述BSA溶液的溶度为10~200 mg/mL；
②
将步骤1）得到的生物素化分子马达加入到步骤
①
所制备的96孔酶标板中，37 ℃振摇反应一定时间，用PBS溶液洗去未结合的生物素化分子马达；并用biotin
‑
BSA溶液封闭；所述振摇反应时间为10~60 min；所述biotin
‑
BSA溶液浓度为10~200 mg/mL；步骤
②
反应结束后，96孔酶标板中固载有分子马达，制得固载分子马达的检测板；
③
将检测探针与步骤
②
反应后的分子马达通过亚基单抗
‑
生物素
‑
链霉亲和素
‑
生物素连接，最终制得固载分子马达生物传感器的检测板。
[0006]所述的一种基于96孔板固载分子马达的传感器检测试剂盒，其特征在于步骤1）中所述生物素化磷脂是16 : 0 Biotinyl PE。
[0007]所述的一种基于96孔板固载分子马达的传感器检测试剂盒，其特征在于步骤2）的步骤
①
中所述链霉亲和素浓度为0.1 mg/mL，步骤2）的步骤
①
中所述BSA溶液的溶度为100 mg/mL。
[0008]所述的一种基于96孔板固载分子马达的传感器检测试剂盒，其特征在于步骤2）的步骤
②
中所述振摇反应时间为30 min，步骤2）的步骤
②
中所述biotin
‑
BSA溶液浓度为50 mg/mL。
[0009]所述的一种基于96孔板固载分子马达的传感器检测试剂盒，其特征在于步骤2）的步骤
③
具体制备过程为：向步骤
②
反应后的固载分子马达的96孔酶标板中加入生物素化亚基单抗，室温下反应0.5~2h后，用PBS溶液洗去游离的生物素化亚基单抗；再加入链霉亲和素溶液，链霉亲和素溶液的浓度为3~10mg/ml，室温下反应10~60min后，用PBS溶液洗去游离的链霉亲和素；最终加入生物素化检测探针，充分反应后，用PBS溶液洗去游离的生物素化检测探针，最终制得固载分子马达生物传感器的检测板。
[0010]所述的一种基于96孔板固载分子马达的传感器检测试剂盒用于P24抗原体外检测的方法，其特征在于包括以下检测步骤：S1：配制一系列不同浓度的P24抗原标准品溶液，分别加入到传感器检测试剂盒的检测板孔内，与分子马达传感器混合反应一定时间，吸走孔内液体并用PBS溶液洗涤；所述混合反应时间为10~60 min；S2：向步骤S1操作后的检测板孔内加入含有ADP的ATP合成溶液，37 ℃合成反应10 ~30min，使ATP合成溶液中的ADP转化为ATP；S3：向步骤S2操作后的检测板孔内加入ATP检测试剂，快速混匀后，在化学发光检测仪上进行读取发光强度，以发光强度为纵坐标、标准品浓度为横坐标绘制标准曲线，拟合得到线性回归方程；
S4：将待测样品配制成溶液，按照上述步骤S1
‑
S3的操作，检测待测样品溶液的发光强度，代入步骤S3的线性回归方程即可推算出检测结果。
[0011]所述的一种基于96孔板固载分子马达的传感器检测试剂盒用于P24抗原体外检测的方法，其特征在于步骤S1中混合反应时间为30min；所述的一种基于96孔板固载分子马达的传感器检测试剂盒用于P24抗原体外检测的方法，其特征在于步骤S2中，所述ATP合成溶液中含有ADP和Mg
2+
，ADP的浓度为0.3mM，Mg
2+
浓度为2mM。
[0012]所述的一种基于96孔板固载分本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于96孔板固载分子马达的传感器检测试剂盒，其特征在于试剂盒由一块分子马达传感器检测板构成，该检测板由F0F1
‑
ATP酶分子马达固载于96孔酶标板形成，同时结合检测探针形成分子马达生物传感器用于捕获靶标，该试剂盒的制备包括以下步骤：1）生物素化分子马达制备：采用生物素化磷脂，在超声条件下与分子马达混合，使生物素化磷脂的亲脂端插入分子马达脂质囊泡的磷脂双分子层中，形成生物素化的分子马达；所述生物素化磷脂为16:0 Biotinyl PE、18:1
‑
12:0 Biotin PE或18:0 Biotinyl PE；所述分子马达为F0F1
‑
ATP酶分子马达；2）检测板制备：
①
用链霉亲和素包被96孔酶标板；所述链霉亲和素浓度0.01~1 mg/L；
②
将步骤1）得到的生物素化分子马达加入到步骤
①
所制备的96孔酶标板中，37 ℃振摇反应一定时间，用PBS溶液洗去未结合的生物素化分子马达；并用biotin
‑
BSA溶液封闭；所述振摇反应时间为10~60 min；所述biotin
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BSA溶液浓度为10~200 mg/mL；步骤
②
反应结束后，96孔酶标板中固载有分子马达，制得固载分子马达的检测板；
③
将检测探针与步骤
②
反应后的分子马达通过亚基单抗
‑
生物素
‑
链霉亲和素
‑
生物素连接，最终制得固载分子马达生物传感器的检测板。2.如权利要求1所述的一种基于96孔板固载分子马达的传感器检测试剂盒，其特征在于步骤1）中所述生物素化磷脂是16 : 0 Biotinyl PE。3.如权利要求1所述的一种基于96孔板固载分子马达的传感器检测试剂盒，其特征在于步骤2）的步骤
①
中所述链霉亲和素浓度为0.1 mg/mL，步骤2）的步骤
①
中所述BSA溶液的溶度为100 mg/mL。4.如权利要求1所述的一种基于96孔板固载分子马达的传感器检测试剂盒，其特征在于步骤2）的步骤
②
中所述振摇反应时间为30 m...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨根生，应三军，高颖，洪伟勇，楼邦，
申请(专利权)人：浙江摩达生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：