本发明专利技术涉及糖基转移酶突变体在定向合成非天然人参皂苷中的应用。所述突变体为将糖基转移酶BcGT1的氨基酸序列中第18位、第133位氨基酸残基中一个或多个突变为另一种氨基酸残基得到;所述糖基转移酶为氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。以本发明专利技术构建的糖基转移酶突变体与蔗糖合成酶AtSuSy双酶偶联催化体系,可实现一步法直接定向合成非天然人参皂苷12
【技术实现步骤摘要】
糖基转移酶突变体在定向合成非天然人参皂苷中的应用
[0001]本专利技术属于中医药的生物制药
,具体涉及一种蜡样芽孢杆菌来源的糖基转移酶BcGT1突变体在酶法制备非天然人参皂苷中的应用。
技术介绍
[0002]人参(Panax ginsengC.A.Mayer)为五加科多年生草本植物,是我国传统的名贵中药。中药人参具有广泛的抗癌、抗疲劳、提高免疫力、保护心脑血管等药理活性。中药人参中含有的主要药用成分——人参皂苷,是一类四环三萜类化合物。迄今为止,已经从17种人参属植物中鉴定出了180种人参皂苷,大多为四环的达玛烷型结构。达玛烷型人参皂苷可进一步分为原人参二醇(PPD)、原人参三醇(PPT)等类型。在自然界中,PPD的糖基化位点通常是C
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3和C
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20的羟基,生成人参皂苷Rh2、Rg3、化合物K、Rb2、Rb3、Rd等产物。而PPT的糖基化位点通常为C
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6和C
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20的羟基,形成人参皂苷Re、Rf、Rg1、Rg2、Rh1、F1等产物,PPT的C
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3、C
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12位羟基不被糖基化修饰。因此,PPT的C
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3、C
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12位糖基化修饰后获得的产物被称为非天然人参皂苷,例如:原人参三醇
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12
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O
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β
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葡萄糖苷(12
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O
‑
β
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D
‑
glucopyranosyl
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20(S)
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protopanaxatriol,简写为12
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O
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β
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Glc
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PPT)、原人参二醇
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12
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O
‑
β
‑
葡萄糖苷(12
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O
‑
β
‑
D
‑
glucopyranosyl
‑
20(S)
‑
protopanaxadiol,简写为12
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O
‑
β
‑
Glc
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PPD)属于非天然人参皂苷,其结构式分别如下。
[0003][0004]有研究表明,一些非天然人参皂苷(单糖苷产物12
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O
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β
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Glc
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PPD)对肺癌细胞的抑制作用明显强于天然人参皂苷Rg3、Rh2等(Atopkina L N,et al;Planta Medica,1999,65(1):30
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34)。因此,通过糖基化反应作用对原人参三醇、原人参二醇的非天然糖基化位点(C
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12)进行糖基化修饰,将能合成具有独特生理和药理活性的新型人参皂苷产物。
[0005]在人参植物中,数量丰富的糖基转移酶类(UGTs)可催化PPT的糖基化修饰,该步骤是人参皂苷生物合成途径的最后一步,也是最为关键的一步,决定了最终生成的人参皂苷产物种类,进而影响其生物活性及功能用途。糖基转移酶通常需要使用“活化糖”作为糖基供体如:UDP
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葡萄糖、UDP
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半乳糖、UDP
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鼠李糖、UDP
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木糖、UDP
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葡萄糖醛酸等。药理研究表明,人参皂苷苷元糖基化和修饰方式不同,形成的不同类型人参皂苷发挥不同的药理作用。在非天然人参皂苷生物法制备方面,有报道将糖基转移酶BsUGT1等多种酶基因导入细胞,先生物合成3,12
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Di
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O
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Glc
‑
PPT(PPT的双糖基化产物),再进一步利用含有水解酶LXXL
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P1
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2的全细胞催化PPT的双糖基化产物特异性水解获得非天然人参皂苷12
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O
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β
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Glc
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PPT(杨金玲等;CN 109666747 A);该制备方法增加了细胞催化制备非天然人参皂苷的步骤,多酶体系组成复杂,并且细胞内代谢副产物众多,不利于非天然人参皂苷12
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β
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O
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Glc
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PPT分离工艺的简化。还有报道以糖基糖基转移酶为催化剂,如:枯草芽孢杆菌来源的糖基转移酶Bs
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YjiC能催化合成人参皂苷Rh1和3
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β
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O
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Glc
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PPT等两种单糖基化产物(孙媛霞等,CN 109796516 A;Dai L H et al,J.Agric.Food Chem.2018,66,943
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949);该酶还能进一步以人参皂苷Rh1或和3
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β
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O
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Glc
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PPT为底物发生糖基化获得4种非天然PPT型人参皂苷(均为双糖基化产物),说明天然糖基转移酶在生物合成非天然人参皂苷产物方面的选择性不尽人意(孙媛霞等,CN 109796516 A;Dai LH et al,J.Agric.Food Chem.2018,66,943
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949);受限于酶自身催化反应的选择性,难以定向制备PPT的单糖基化产物或其单一的产物。此外,鲜见有以糖基转移酶一步法直接制备单糖苷的非天然人参皂苷(12
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O
‑
β
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Glc
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PPT)产物的报道。
[0006]目前,利用糖基转移酶催化的转糖基化反应主要有三种方式:第一是在体外以高能活化糖为糖基供体进行糖基转移酶催化。为达到较高的底物糖基化转化率,往往需要加入过量的活化糖供体,但高能活化糖的价格高昂,所需反应成本较高,难以大规模应用;第二是在含有糖基转移酶的重组菌体内进行全细胞转化。虽然体内反应可以显著降低反应成本但是底物需要跨膜进入细胞,甚至有些底物对细胞有较强的毒性,摄入后会严重抑制细胞活性,导致糖基化反应产率大幅度下降;第三是在体外通过引入蔗糖合成酶构建糖基转移酶
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蔗糖合成酶偶联催化体系,以尿苷二磷酸二钠(UDP)及蔗糖为底物,蔗糖合成酶实现反应体系中UDP
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G(尿苷二磷酸葡萄糖)的循环再生,UDP
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G被糖基转移酶作为糖基供体催化糖基化反应同时释放UDP。使用双酶偶联催化反应既可以实现UDP
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G的循环再生,同时循环体系所需的极少量的UDP也可以消除糖基转移酶催化过程中产生的大量副产物UDP对糖基转移酶本身活性的抑制,从而实现糖苷类产物的低成本本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.糖基转移酶突变体在定向合成非天然人参皂苷中的应用,其特征在于,所述突变体为将糖基转移酶BcGT1的氨基酸序列中第18位、第133位氨基酸残基中一个或多个突变为另一种氨基酸残基得到;所述糖基转移酶为氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述糖基转移酶BcGT1的第18位脯氨酸残基突变为丙氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、天冬氨酸其中的任意一种。3.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述糖基转移酶BcGT1的第133位苯丙氨酸残基突变为丙氨酸、酪氨酸、脯氨酸、天冬氨酸、丝氨酸其中的任意一种。4.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述糖基转移酶BcGT1的突变体为F133Y突变体、F133S突变体、P18F/F133Y突变体、P18M/F133Y突变体或P18D/F133Y突变体。5.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述非天然人参皂苷为原人参三醇
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12
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O
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β
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葡萄糖苷、原人参二醇
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12
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O
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β
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葡萄糖苷或原人参三醇
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【专利技术属性】
技术研发人员:何冰芳,徐晓丽,储建林,赵璐,钦松,高振,吴斌,
申请(专利权)人:南京工业大学,
类型:发明
国别省市:
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