嵌合三萜合酶和三萜化合物制造技术

本发明专利技术公开了嵌合三萜合酶和三萜化合物，属于生物技术领域。本发明专利技术的嵌合三萜合酶为氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的CgCS、氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的TvTS或氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的MpMS。本发明专利技术的嵌合三萜合酶能够产生结构新颖的三萜化合物。酶能够产生结构新颖的三萜化合物。酶能够产生结构新颖的三萜化合物。

Chimeric triterpene synthase and triterpene compounds

【技术实现步骤摘要】
嵌合三萜合酶和三萜化合物


[0001]本专利技术属于生物
，涉及三个真菌来源的嵌合三萜合酶和嵌合三萜合酶产生的结构新颖的三萜化合物。

技术介绍

[0002]萜类化合物是自然界中数量最多的一类天然产物，主要分布在真菌、植物以及细菌中。真菌来源的萜类化合物因其新颖且多样化的结构以及显著的药理活性，成为天然产物生物合成领域的研究热点。其生物合成首先是通过甲羟戊酸(mevalonate，MVA)途径合成萜类前体物质，异戊烯焦磷酸(isopentenyl diphosphate，IPP)和烯丙基焦磷酸(dimethylallyl diphosphate，DMAPP)；然后异戊烯转移酶(prenyltransferases，PT)催化DMAPP和IPP缩合形成不同链长的异戊烯基前体物质(C10
‑
C25)；随后在萜类合酶(terpene synthase，TS)作用下形成单萜、倍半萜、二萜、二倍半萜、三萜以及多萜等一系列结构多样的萜类骨架化合物；最后这些骨架化合物在各种修饰酶(如P450酶、脱水酶、甲基转移酶)的作用下形成结构复杂多样且具有生理活性的萜类化合物。
[0003]PT和TS是萜类化合物的生物合成中至关重要的两个酶。通常情况下，PT和TS是连续且独立发挥作用的两种酶，然而，有一些真菌来源萜类合酶同时具有PT结构域和I型TS结构域，属于嵌合类萜类合酶。这类型的酶通常被报道主要产生二倍半萜以及少量的二萜化合物，从未见三萜产物的报道。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供同时具有异戊烯转移酶活性和萜类合酶活性的可产生三萜化合物的嵌合三萜合酶及其应用。
[0005]本专利技术的目的还在于提供通过所述嵌合三萜合酶产生的结构新颖的三萜化合物。
[0006]本专利技术的目的通过下述技术方案实现：
[0007]本专利技术所提供的嵌合三萜合酶，为Colletotrichum gloeosporioides来源的CgCS、Talaromyces verruculosus来源的TvTS或Macrophomina phaseolina来源的MpMS；其中，CgCS的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，TvTS的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，MpMS的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0008]编码上述嵌合三萜合酶CgCS、TvTS、MpMS的核酸分子的核苷酸序列分别优选如SEQ ID NO.4、5、6所示。
[0009]一种可表达上述嵌合三萜合酶的重组质粒，含有上述核酸分子。
[0010]一种可表达上述嵌合三萜合酶的重组细胞，含有上述核酸分子或重组质粒。在一些实施方案中，所述的重组细胞以酿酒酵母作为宿主。
[0011]上述嵌合三萜合酶、核酸分子、重组质粒或重组细胞可用于制备三萜化合物，所述的三萜化合物为结构如式I所示的化合物2colleterpenol(2)或结构如式II所示的化合物1talaropentaene(1)。其中，化合物1talaropentaene(1)由TvTS合成，化合物
2colleterpenol(2)由CgCS合成。
[0012][0013]一种制备上述三萜化合物的方法，包括如下步骤：培养上述重组细胞得到含所述三萜化合物的培养物。
[0014]本专利技术所提供的三萜化合物为结构如式I所示的colleterpenol或结构如式II所示的talaropentaene。
[0015]本专利技术的优点和有益效果：本专利技术发现了同时具有异戊烯转移酶活性和萜类合酶活性的嵌合三萜合酶，其可用于制备三萜化合物。
附图说明
[0016]图1是化合物1talaropentaene的GC检测图。
[0017]图2是化合物2colleterpenol的GC检测图。
[0018]图3是化合物3的GC检测图。
[0019]图4是化合物1talaropentaene的MS图。
[0020]图5是化合物2colleterpenol的MS图。
[0021]图6是化合物3的MS图。
[0022]图7是化合物的结构鉴定，化合物1和2关键的HMBC、1H
‑1H COSY和NOESY相关。
[0023]图8是化合物1的氢谱图(C6D6,600MHz)。
[0024]图9是化合物1的
13
C
‑
NMR谱图(C6D6,150MHz)。
[0025]图10是化合物1的
13
C
‑
DEPT谱图(C6D6,150MHz)。
[0026]图11是化合物1的1H
‑1H
‑
COSY谱图(C6D6)。
[0027]图12是化合物1的HSQC谱图(C6D6)。
[0028]图13是化合物1的HMBC谱图(C6D6)。
[0029]图14是化合物1的NOESY谱图(C6D6)。
[0030]图15是化合物2的氢谱图(C6D6,600MHz)。
[0031]图16是化合物2的
13
C
‑
NMR谱图(C6D6,150MHz)。
[0032]图17是化合物2的
13
C
‑
DEPT谱图(C6D6,150MHz)。
[0033]图18是化合物2的1H
‑1H
‑
COSY谱图(C6D6)。
[0034]图19是化合物2的HSQC谱图(C6D6)。
[0035]图20是化合物2的HMBC谱图(C6D6)。
[0036]图21是化合物2的NOESY谱图(C6D6)。
具体实施方式
[0037]以下实施例用于进一步说明本专利技术，但不应理解为对本专利技术的限制。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0038]实施例1三个嵌合三萜合酶(TvTS、CgCS和MpMS)表达质粒的构建
[0039]根据菌株Colletotrichum gloeosporioides ES026基因组测序结果，以及嵌合萜类合酶的具有的保守结构域3个DDXXD/E和1个NSE/DTE序列，筛选得到CgCS基因，以菌株Colletotrichum gloeosporioides ES026的cDNA为模板扩增CgCS基因(CgCS基因序列见SEQ ID NO.4)，以pGB315为模板(序列见SEQ ID NO.7)扩增质粒骨架。然后再利用酵母组装或者Gibson将两个片段组装起来。
[0040]在NCBI和Uniprot数据库中搜索，限定氨基酸长度为700
‑
900，下载所有符合的核苷酸/蛋白质序列，然后将所下载的序列进行分析，筛选出具有嵌合萜类合酶保守结构域DDXXD/E和NSE/DTE的序列，进行基因合成，获得pUC57
‑
PTTS1本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种嵌合三萜合酶，其特征在于：为氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的CgCS、氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的TvTS或氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的MpMS。2.编码权利要求1所述的嵌合三萜合酶的核酸分子，其特征在于：编码CgCS、TvTS、MpMS的核酸分子的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.4、5、6所示。3.一种重组质粒，其特征在于：含有权利要求2所述的核酸分子。4.一种重组细胞，其特征在于：含有权利要求2所述的核酸分子...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘天罡，
申请(专利权)人：武汉大学，
类型：发明
国别省市：