高效表达菌丝霉素的重组工程菌及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种高效表达菌丝霉素的重组工程菌，其基因组中包含有菌丝霉素四倍串联体，菌丝霉素四倍串联体是由4个编码菌丝霉素的基因片段依次通过编码T2A肽的基因片段串联在一起而成的，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。其构建方法为：在菌丝霉素N端加6

Recombinant engineering bacteria with high expression of mycomycin and its application

【技术实现步骤摘要】
高效表达菌丝霉素的重组工程菌及其应用


[0001]本专利技术涉及高效表达菌丝霉素的重组工程菌及其应用，属于基因工程


技术介绍

[0002]抗菌肽是机体天然免疫系统的重要组成部分，通常是一道抵抗病原体的关键防线。抗菌肽以其高抗菌活性、安全性和独特的作用机制等优势被认为是传统抗生素的最佳替代品，对它的研究与开发受到广泛关注，人们期望抗菌肽成为抗生素的理想替代品之一。直接从自然资源中获得的抗菌肽提取分离工艺复杂、成本高，抗菌肽产品产率低且杂质含量高，因此寻求一种高效的表达抗菌肽的方法至关重要。
[0003]目前已经成功实现菌丝霉素在毕赤酵母GS115中的表达，但其表达量并未达到理想水平，因此有必要研发一种能高效表达菌丝霉素的方法。

技术实现思路

[0004]针对上述现有技术，本专利技术提供了一种高效表达菌丝霉素的重组工程菌及其构建方法与应用。
[0005]本专利技术是通过以下技术方案实现的：一种高效表达菌丝霉素的重组工程菌，其基因组中包含有菌丝霉素四倍串联体，所述菌丝霉素四倍串联体是由4个编码菌丝霉素的基因片段依次通过编码T2A肽的基因片段串联在一起而成的。
[0006]所述编码菌丝霉素的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述菌丝霉素的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0007]编码菌丝霉素的基因的核苷酸序列如下所示（SEQ ID NO.1）：5
’‑
GGTTTCGGCTGTAACGGACCTTGGGACGAGGACGACATGCAATGTCACAACCACTGTAAATCTATCAAGGGATACAAGGGTGGCTACTGTGCTAAGGGAGGTTTTGTTTGCAAGTGCTAC
‑3’
。
[0008]菌丝霉素的氨基酸序列如下所示（SEQ ID NO.2）：GFGCNGPWDEDDMQCHNHCKSIKGYKGGYCAKGGFVCKCY。
[0009]所述编码T2A肽的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述T2A肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
[0010]编码T2A肽的基因的核苷酸序列如下所示（SEQ ID NO.3）：5
’‑
GAAGGACGTGGATCCCTTTTGACCTGCGGAGATGTCGAAGAGAATCCTGGACCT
‑3’
。
[0011]T2A肽的氨基酸序列如下所示（SEQ ID NO.4）：EGRGSLLTCGDVEENPGP。
[0012]进一步地，所述重组工程菌的宿主菌为毕赤酵母菌。
[0013]所述高效表达菌丝霉素的重组工程菌的构建方法为：在菌丝霉素N端加6
×
His标签用于纯化，在菌丝霉素的C端添加T2A肽序列与下一组基因表达盒连接，以这种方式构建菌丝霉素的四倍串联体；将重组表达载体转化至宿主感受态细胞，得到重组工程菌。
[0014]所述高效表达菌丝霉素的重组工程菌在制备菌丝霉素中的应用，在抑制金黄色葡萄球菌中的应用，在制备抑制金黄色葡萄球菌的制剂中的应用。
[0015]本专利技术的高效表达菌丝霉素的重组工程菌，可高效表达菌丝霉素，可用于菌丝霉素的制备，菌丝霉素可用于抑制金黄色葡萄球菌。具体应用时，制备菌丝霉素的方法为：培养上述高效表达菌丝霉素的重组工程菌，离心收集上清液，冻干，即得。
[0016]进一步地，具体方法为：将高效表达菌丝霉素的重组工程菌接入YPD液体培养基中，30℃、220 rpm培养16 h，制备种子液；取种子液，按10%（v/v）的接菌量接入BMGY培养基中，30℃、220 rpm培养至OD
600
为2.0～6.0；菌液离心（4000
×
g，离心10 min），用BMMY培养基将菌体重悬，置于发酵罐中，30℃发酵培养，每24 h补加一次甲醇使其终浓度为1%（体积比），发酵24 h以上；发酵液离心，收集上清液，冻干，即得菌丝霉素粉制剂。
[0017]一种菌丝霉素的重组表达载体，为菌丝霉素的四倍串联体，是由4个编码菌丝霉素的基因片段依次通过编码T2A肽的基因片段串联在一起而成的。其构建方法为：在菌丝霉素N端加6
×
His标签用于纯化，在菌丝霉素的C端添加T2A肽序列与下一组基因表达盒连接，以这种方式构建菌丝霉素的四倍串联体。
[0018]所述菌丝霉素的重组表达载体在制备表达菌丝霉素的重组工程菌中的应用。
[0019]本专利技术的重组工程菌，基于T2A肽组装将四个菌丝霉素单体用T2A肽连接，构建菌丝霉素的四倍串联体。T2A肽来源于明脉扁刺蛾病毒，是一种能够“自裂解”小肽，T2A肽是目前发现的序列最短的 2A 肽，但其剪切效率接近100%。基于T2A肽构建的菌丝霉素四倍串联表达载体，转入毕赤酵母GS115中诱导表达后，在转录翻译后T2A肽可进行“自裂解”，得到高表达量的菌丝霉素单体。菌丝霉素具有很好的温度稳定性和pH稳定性，即使在100℃的高温下，活性在4 h内仍能保持50%以上，为喷雾干燥等工业应用提供了基础。菌丝霉素对胃蛋白酶和木瓜蛋白酶具有较高的耐受性，在120 h内仍能保持良好的活性，这保证了菌丝霉素在进入动物胃肠道后不会立即被水解，这极利于其在饲料领域的发展。
[0020]本专利技术的重组工程菌，将菌丝霉素四倍串联体转入宿主中，可使菌丝霉素的表达量得到明显提高，具有良好的应用前景。实验表明，由T2A组装的菌丝霉素串联中菌丝霉素的表达水平是单倍体的2.3倍，四个菌丝霉素基因通过T2A肽串联后，菌丝霉素在总分泌蛋白中的含量明显增加，由计算结果分析得到，以菌丝霉素4倍串联的基因表达倍数约是单倍体的4771倍，表明从基因转录水平上来看T2A肽起到了非常显著的提升效果，而且菌丝霉素4倍串联菌株菌丝霉素的分泌量显著高于单倍体菌丝霉素菌株。此外，菌丝霉素4倍串联菌株的抑菌活性是单倍体菌株的1.5倍。菌丝霉素在总分泌蛋白中的含量是单倍体表达的2.3倍。
[0021]本专利技术使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义。
附图说明
[0022]图1：pPIC9k
‑
4Plectasin的质粒图谱。
[0023]图2：基于T2A肽组装的菌丝霉素四倍串联体基因表达框示意图。
[0024]图3：阳性克隆子PCR扩增产物的核酸电泳图。
[0025]图4：发酵液上清的抑菌活性示意图，其中，左：菌丝霉素4倍串联对S. aureus ATCC 26001的抑制效果；右：菌丝霉素单倍体对S. aureus ATCC 26001的抑制效果。
[0026]图5：温度变化对菌丝霉素活性的影响示意图。
[0027]图6：pH变化对菌丝霉素活性的影响示意图。
[0028]图7：菌丝霉素在5L发酵罐水平最佳发酵时间示意图。
[0029]图8：菌丝霉素蛋白酶解耐受性示意图。
[0030]图9：不同甲醇浓度诱导菌本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种高效表达菌丝霉素的重组工程菌，其特征在于：其基因组中包含有菌丝霉素四倍串联体，所述菌丝霉素四倍串联体是由4个编码菌丝霉素的基因片段依次通过编码T2A肽的基因片段串联在一起而成的。2.根据权利要求1所述的高效表达菌丝霉素的重组工程菌，其特征在于：所述编码菌丝霉素的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述编码T2A肽的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。3.根据权利要求1所述的高效表达菌丝霉素的重组工程菌，其特征在于：所述菌丝霉素四倍串联体的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。4.根据权利要求1所述的高效表达菌丝霉素的重组工程菌，其特征在于：所述重组工程菌的宿主菌为毕赤酵母菌。5.权利要求1～4中任一项所述的高效表达菌丝霉素的重组工程菌的构建方法，其特征在于：在菌丝霉素N端加6
×
His标签用于纯化，在菌丝霉素的C端添加T2A肽序列与下一组基因表达盒连接，以此种方式构建菌丝霉素的四倍串联体；将重组表达载体转化至宿主感受态细胞，得到重组工程菌。6.权利要求1～4中任一项所述的高效表达菌丝霉...

【专利技术属性】
技术研发人员：毛相朝，姜宏，司先懂，梁星星，董格菲，任泽林，陈鹏，
申请(专利权)人：北京英惠尔生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：