一种表达犬白介素6的重组质粒、稳定表达犬白介素6蛋白的细胞株及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种表达犬白介素6的重组质粒、稳定表达犬白介素6蛋白的细胞株及其制备方法和应用。本发明专利技术首先构建了表达犬白介素6的重组质粒，将所述重组质粒导入中国仓鼠卵巢细胞(CHO)，筛选得到稳定表达犬白介素6蛋白的细胞株，所述细胞株传代培养20次仍可稳定表达犬白介素6蛋白，且细胞株表达犬白介素6蛋白的能力不受冻存及复苏的影响；所述细胞株表达犬白介素6蛋白是将犬白介素6蛋白分泌至细胞上清，纯化更方便，所得纯化蛋白更接近天然蛋白分子，具备促进淋巴细胞增殖的生物活性，可作为佐剂增强疫苗的免疫效果。为佐剂增强疫苗的免疫效果。为佐剂增强疫苗的免疫效果。

【技术实现步骤摘要】
一种表达犬白介素6的重组质粒、稳定表达犬白介素6蛋白的细胞株及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及分子生物免疫学
，具体地，涉及一种表达犬白介素6的重组质粒、稳定表达犬白介素6蛋白的细胞株及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]白细胞介素6(Interleukin
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6，IL
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6)，最初被描述为B细胞刺激因子，现在被称为多效性细胞因子，属于细胞因子网络中的重要成员。IL
‑
6可由T细胞、B细胞、单核巨噬细胞及内皮细胞等分泌，又可促进多种细胞的生长和分化。IL
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6在急性炎症反应中处于中心地位，可介导肝脏的急性期反应，刺激C反应蛋白(CRP)和C纤维蛋白原的生成。IL
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6具有致炎和抗炎的双向功能，它的作用与组织中的含量有关。当机体内的IL
‑
6水平属于正常水平，则对机体有利；反之高水平会引起一系列炎性损害。有研究表明，在炎症、感染和患有某些肿瘤等情况下，血清中IL
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6的含量会有不同程度上升，且IL
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6水平与患者预后密切相关。
[0003]IL
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6属于Th2型细胞因子，可以介导各种免疫应答，能够刺激活化后期的B细胞大量合成分泌型抗体，刺激T细胞增殖，还能够与IL
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2、TNF
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α等细胞因子相互诱生，共同构成复杂的细胞因子网络，从而同时提高机体的体液免疫和细胞免疫水平，在机体的抗感染免疫反应中起着重要的作用。因此，IL
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6常作为分子佐剂增强疫苗的免疫应答效应。而现有技术中利用犬IL
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6的是将犬IL
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6的基因与病毒基因结合，如中国专利技术专利CN106967691A以狂犬病毒rHEP
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Flury为亲本毒株基础上，插入了犬IL
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6基因的重组狂犬病病毒，从而产生比亲本株介导更强的免疫应答，诱导机体产生更高的中和抗体。但是，IL6作为一种炎症因子，过量表达或使用会会引起过度的炎症反应而损害机体，因此，有必要研究单独的犬IL
‑
6蛋白是否可以作为佐剂，并通过控制犬IL
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6蛋白作为佐剂的用量避免IL6过表达导致的影响。现有技术虽然有利用犬IL
‑
6重组质粒表达犬IL
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6蛋白，如中国专利技术专利CN113376380A，利用pET
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IL6重组质粒转染并表达犬IL
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6蛋白，然而其利用的是大肠杆菌原核表达系统，犬IL
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6蛋白的获得方法比较复杂，操作步骤多，因此有必要提供一种更方便的犬IL
‑
6蛋白的获得方法。

技术实现思路

[0004]为了解决现有技术中犬IL
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6蛋白的制备方法的缺陷和不足，提供一种表达犬白介素6的重组质粒、稳定表达犬白介素6蛋白的细胞株及其制备方法和应用。
[0005]本专利技术的目的在于提供一种表达犬白介素6的重组质粒。
[0006]本专利技术的目的还在于提供一种稳定表达犬白介素6蛋白的细胞株的制备方法。
[0007]本专利技术的目的还在于提供所述制备方法制备得到的细胞株。
[0008]本专利技术的目的还在于提供利用所述细胞株在制备犬白介素6蛋白中的应用。
[0009]本专利技术的目的还在于提供一种制备犬白介素6蛋白的方法。
[0010]本专利技术的目的还在于提供所述方法制备得到的犬白介素6蛋白。
[0011]本专利技术的目的还在于提供犬白介素6蛋白在促进淋巴细胞增殖中的应用。
[0012]本专利技术的目的还在于提供所述犬白介素6蛋白在制备犬类疾病治疗药物中应用。
[0013]本专利技术首先构建了表达犬白介素6的重组质粒，将所述重组质粒导入中国仓鼠卵巢细胞(CHO)，筛选得到稳定表达犬白介素6蛋白的细胞株，所述细胞株传代培养20次仍可稳定表达犬白介素6蛋白，且细胞株表达犬白介素6蛋白的能力不受冻存及复苏的影响；所述细胞株表达犬白介素6蛋白是将犬白介素6蛋白分泌至细胞上清，纯化更方便，所得纯化蛋白更接近天然蛋白分子。
[0014]本专利技术的上述目的通过以下技术手段实现：
[0015]一种表达犬白介素6的重组质粒，连接有核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示基因片段的表达载体。
[0016]优选地，所述表达载体为pcDNA3.1(+)。
[0017]优选地，所述重组质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。
[0018]所述重组质粒的构建方法，以核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示的序列为模板，利用引物合成犬白介素6(犬IL
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6)基因，将犬IL
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6基因和表达载体分别用限制性核酸内切酶HindⅢ和BamHⅠ酶切，将酶切后的犬IL
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6基因片段和表达载体用T4连接酶连接即得重组质粒；所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示。
[0019]所述重组质粒在制备犬白介素6蛋白中的应用也在本专利技术的保护范围之内。
[0020]一种稳定表达犬白介素6蛋白的细胞株的制备方法，包括以下步骤：将所述重组质粒导入哺乳动物细胞系；并进行加压筛选和单克隆筛选；对加压筛选和单克隆筛选得到细胞株进行鉴定，即得到表达犬白介素6蛋白的细胞株。
[0021]优选地，所述重组质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。
[0022]优选地，所述哺乳动物细胞系为中国仓鼠卵巢细胞系。
[0023]中国仓鼠卵巢细胞(CHO)表达系统，与其他蛋白表达系统相比，该系统具有准确的转录后修饰功能，表达的糖基化药物蛋白在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然蛋白分子；具有产物胞外分泌功能，且很少分泌自身的内源蛋白，便于产物分离纯化；具有重组基因的高效扩增和表达能力；可贴壁生长，也可悬浮生长，适合大规模培养。
[0024]优选地，所述加压筛选及单克隆的细胞筛选的筛选试剂为遗传霉素(G418)。
[0025]优选地，所述加压筛选的培养基中遗传霉素的终浓度为700μg/mL～900μg/mL；所述单克隆筛选的培养基中遗传霉素的终浓度为350μg/mL～450μg/mL。
[0026]更优选地，所述加压筛选的培养基中遗传霉素的终浓度为800μg/mL；所述克隆筛选的培养基中遗传霉素的终浓度为400μg/mL。
[0027]优选地，所述单克隆筛选鉴定的步骤共重复2～3次。
[0028]更优选地，所述单克隆筛选鉴定的步骤共重复3次。
[0029]利用所述制备方法制得的稳定表达犬白介素6蛋白的细胞株也应在本专利技术的保护范围之内。所述细胞株能稳定表达犬白介素6蛋白。
[0030]所述细胞株在制备犬白介素6蛋白中的应用也应在本专利技术的保护范围之内。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种表达犬白介素6的重组质粒，其特征在于，连接有核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示基因片段的表达载体。2.根据权利要求1所述重组质粒，其特征在于，所述表达载体为pcDNA3.1(+)。3.根据权利要求1所述重组质粒，其特征在于，所述重组质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。4.权利要求1～3任一所述重组质粒在制备犬白介素6蛋白中的应用。5.一种稳定表达犬白介素6蛋白的细胞株的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将所述重组质粒导入哺乳动物细胞系；并进行加压筛选和单克隆筛选；对...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭霄峰，赖艳琴，陈桂娥，刘思泽，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：