用于结合纤溶酶原的抗体制造技术

本发明专利技术涉及包含结合纤溶酶原的抗原结合结构域的抗原结合蛋白，包含该抗原结合蛋白的药物组合物，及其方法和用途，其中该抗原结合蛋白降低纤溶酶原激活为纤溶酶。蛋白降低纤溶酶原激活为纤溶酶。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于结合纤溶酶原的抗体


[0001]本专利技术涉及用于结合纤溶酶原的抗原结合蛋白及其相关片段，涉及所述抗原结合蛋白和片段的产生，并且涉及所述抗体和片段用于检测和治疗各种病症的用途。
[0002]相关申请
[0003]本申请要求澳大利亚临时申请AU 2019904052的优先权，将其内容通过引用以其全文特此并入。

技术介绍

[0004]纤溶酶原(PLG)是纤溶酶的无活性酶原形式，纤溶酶是一种丝氨酸蛋白酶，其对靶底物(包括纤维蛋白、纤维蛋白原、补体组分3和5(C3和C5)、玻连蛋白、骨钙素、因子V、因子VIII和因子X以及一些胶原酶)具有广泛的特异性。因此，PLG和PLM一起参与各种重要的生理和病理过程，包括纤维蛋白溶解和止血、细胞外基质的降解、细胞迁移、胚胎发育、组织重塑、炎症、伤口愈合、血管生成和肿瘤侵袭。
[0005]PLG主要在肝脏中合成，但也在主要器官和组织中合成。因此，在血浆和许多血管外液体中发现了大量的PLG。在生理条件下，PLG通过激活环中的切割被转化为活性形式纤溶酶(PLM)。激活可由尿激酶纤溶酶原激活物(urokinase plasminogen activator，uPA)或组织纤溶酶原激活物(tissue plasminogen activator，tPA)或各种其他蛋白酶介导，并将单链PLG(氨基酸残基20
‑
810)转化为由二硫键连接的重链A(残基20
‑
580)和轻链B(残基581
‑
810)组成的PLM。重链A含有5个克林格勒(kringle)结构域(其经由赖氨酸结合区介导与底物的结合)，并且轻链B对应于丝氨酸蛋白酶结构域。由前4个克林格勒结构域组成的片段已被命名为血管抑素，一种新的血管生成抑制剂。
[0006]纤溶酶原/纤溶酶系统与多种生理和病理过程(如纤维蛋白溶解、组织重塑、细胞迁移、炎症以及肿瘤侵袭和转移)有关。纤溶酶原的遗传性缺陷是血栓栓塞性疾病的诱发危险因素。
[0007]需要用于调节纤溶酶系统以治疗和/或预防各种病症的组合物和方法。
[0008]在本说明书中对任何现有技术的提及并不是承认或暗示此现有技术形成任何管辖权的公知常识的一部分，或者此现有技术可合理地预期被理解为被认为与本领域技术人员已知的其他现有技术是相关的和/或与之组合。

技术实现思路

[0009]本专利技术提供了一种抗原结合蛋白，其包含结合纤溶酶原的抗原结合结构域，其中该抗原结合蛋白降低纤溶酶原的激活。
[0010]在任何方面，本专利技术的抗原结合蛋白可以减少任何一种或多种纤溶酶原激活物对纤溶酶原的激活。纤溶酶原激活物是可以切割Arg
561
‑
Val
562
键(按照人纤溶酶原编号)的任何酶。示例性纤溶酶原激活物是切割纤溶酶原的丝氨酸蛋白酶，包括凝血蛋白因子IX、因子X和凝血酶原(因子II)、蛋白C、胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶、各种白细胞弹性蛋白酶、链激酶
(streptokinase，SK)、葡激酶、尿激酶纤溶酶原激活物(uPA)、组织纤溶酶原激活物(tPA)和纤溶酶。优选地，纤溶酶原激活物选自由以下组成的组：链激酶(SK)、尿激酶纤溶酶原激活物(uPA)和组织纤溶酶原激活物(tPA)。优选地，在纤溶酶原/纤溶酶的一种或多种配体或底物存在下，减少了SK、uPA和/或tPA介导的纤溶酶原的激活。优选地，辅因子选自由以下组成的组：ε
‑
氨基己酸(EACA)或其他赖氨酸类似物、纤维蛋白原(Fg)和纤维蛋白(Fn)。测量纤溶酶原激活的方法是本领域已知的，并且可以用于确定本专利技术的抗原结合蛋白对纤溶酶原激活的减少。本文描述了示例性方法。纤溶酶原激活的减少可以通过测量活性纤溶酶形成量的减少来确定。
[0011]在任何方面，本专利技术的抗原结合蛋白不可检测地抑制或显著抑制纤溶酶的活性。在进一步的方面，本专利技术的抗原结合蛋白不可检测地结合纤溶酶的活性位点(即催化三联体)。抗原结合蛋白与纤溶酶的结合可以通过本文所述的任何方法来测定。
[0012]在任何方面，本专利技术的抗原结合蛋白结合纤溶酶原的克林格勒结构域，优选地结合克林格勒结构域5。在任何方面，本专利技术的抗原结合蛋白结合纤溶酶原的克林格勒结构域和丝氨酸蛋白酶结构域。在本专利技术的任何方面，抗原结合蛋白结合纤溶酶原的克林格勒结构域、激活环和丝氨酸蛋白酶结构域。在任何方面，本专利技术的抗原结合结构域仅结合纤溶酶原的一个区域，该区域包括纤溶酶原的激活环和克林格勒结构域，优选克林格勒5，但不包括丝氨酸蛋白酶结构域。换句话说，本专利技术的抗原结合结构域优选地不结合不包括激活环的纤溶酶原区域。在任何方面，本专利技术的抗原结合蛋白结合纤溶酶原的丝氨酸蛋白酶结构域，但不结合克林格勒结构域。在进一步的方面，本专利技术的抗原结合蛋白也与丝氨酸蛋白酶结构域相互作用。
[0013]在任何方面，本专利技术的抗原结合蛋白结合包含纤溶酶原的激活环的纤溶酶原区域。优选地，包含激活环的区域包含纤溶酶原的Arg
493
至His
569
之间的氨基酸序列(按照SEQ ID NO:65中提供的人纤溶酶原编号)，或包含Lys
468
和His
569
之间的序列，更优选地，其中激活环包含根据SEQ ID NO:65中所示编号的纤溶酶原的Ala
543
至Arg
582
的序列。优选地，抗原结合蛋白结合包含如SEQ ID NO:66中所示的序列或其片段的肽。优选地，本专利技术的抗原结合蛋白结合纤溶酶原的纤溶酶原环中残基Arg
561
和Val
562
中的一个或多个。
[0014]在任何方面，本专利技术的抗原结合蛋白在Arg
493
、Ser
495
、Ile
496
、Asp
516
、Gly
517
、Asp
518
、Val
519
、Tyr
525
和Tyr
533
的位置或等同位置处结合纤溶酶原的克林格勒5结构域的一个或多个残基。优选地，本专利技术的抗原结合蛋白在表2所示的位置或等同位置处结合纤溶酶原的克林格勒5结构域的一个或多个残基。优选地，结合纤溶酶原的克林格勒5结构域的一个或多个残基的本专利技术抗原结合蛋白的残基是所定义的残基，或者是与表2中所示等同位置处的氨基酸残基。
[0015]在任何方面，本专利技术的抗原结合蛋白在Lys
468
、Arg
493
、Ser
495
、Ile
496
、Asp
516
、Gly
517
和Tyr
525
的位置或等同位置处结合纤溶酶原的克林格勒5结构域的一个或多个残基。优选地，本专利技术的抗原结合蛋白在表3所示的位置或等同位置处结合纤溶酶原的克林格勒5结构域的一个本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种抗原结合蛋白，其包含结合纤溶酶原的抗原结合结构域，其中该抗原结合蛋白降低纤溶酶原的激活。2.如权利要求1所述的抗原结合蛋白，其中该抗原结合蛋白减少或抑制任何一种或多种纤溶酶原激活物对纤溶酶原的激活。3.如权利要求2所述的抗原结合蛋白，其中该纤溶酶原激活物是可以切割纤溶酶原的Arg
561
‑
Val
562
键(按照人纤溶酶原编号)的任何酶，任选地，其中该纤溶酶原激活物是选自由以下组成的组的切割纤溶酶原的丝氨酸蛋白酶：凝血蛋白因子IX、因子X和凝血酶原(因子II)、蛋白C、胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶、各种白细胞弹性蛋白酶、链激酶(SK)、葡激酶、尿激酶纤溶酶原激活物(uPA)、组织纤溶酶原激活物(tPA)和纤溶酶。4.如权利要求1至3中任一项所述的抗原结合蛋白，其中该抗原结合蛋白结合纤溶酶原的激活环。5.如权利要求1至4中任一项所述的抗原结合蛋白，其中该抗原结合蛋白结合纤溶酶原的克林格勒(kringle)结构域，优选地结合克林格勒结构域5。6.如权利要求1至5中任一项所述的抗原结合蛋白，其中该抗原结合蛋白还结合纤溶酶原的克林格勒结构域5和丝氨酸蛋白酶结构域。7.如权利要求1至6中任一项所述的抗原结合蛋白，其中该抗原结合蛋白结合包含纤溶酶原的Arg
493
至His
569
之间的氨基酸序列(如SEQ ID NO:65中所示)或由其组成的纤溶酶原区域，优选地，其中该蛋白结合包含Lys
468
至His
569
之间的氨基酸序列或由其组成的区域，更优选地，其中该激活环包含根据SEQ ID NO:65所示编号的纤溶酶原的Ala
543
至Arg
582
的序列。8.如权利要求1至7中任一项所述的抗原结合蛋白，其中该抗原结合蛋白结合包含如SEQ ID NO:66中所示的序列或其片段或由其组成或基本上由其组成的肽。9.如权利要求1至8中任一项所述的抗原结合蛋白，其中该抗原结合蛋白在Arg
493
、Ser
495
、Ile
496
、Asp
516
、Gly
517
、Asp
518
、Val
519
、Tyr
525
和Tyr
533
的位置或等同位置处结合纤溶酶原的克林格勒5结构域的一个或多个残基，优选地，其中该抗原结合蛋白在表2所示的位置或等同位置处结合纤溶酶原的克林格勒5结构域的一个或多个残基。10.如权利要求1至9中任一项所述的抗原结合蛋白，其中该抗原结合蛋白在Glu
554
、Lys
556
、Lys
557
、His
569
和Asp
751
的位置或等同位置处结合纤溶酶原的丝氨酸蛋白酶结构域的一个或多个残基，优选地，其中本发明的抗原结合蛋白在表2所示的位置或等同位置处结合纤溶酶原的丝氨酸蛋白酶结构域的一个或多个残基。11.如权利要求1至8中任一项所述的抗原结合蛋白，其中该抗原结合蛋白在Lys
468
、Arg
493
、Ser
495
、Ile
496
、Asp
516
、Gly
517
和Tyr
525
的位置或等同位置处结合纤溶酶原的克林格勒5结构域的一个或多个残基，优选地，其中本发明的抗原结合蛋白在表3所示的位置或等同位置处结合纤溶酶原的克林格勒5结构域的一个或多个残基。12.如权利要求1至8或11中任一项所述的抗原结合蛋白，其中该抗原结合蛋白在Glu
554
、Lys
556
、Lys
557
、Arg
561
和His
569
的位置或等同位置处结合纤溶酶原的丝氨酸蛋白酶结构域的一个或多个残基，优选地，其中本发明的抗原结合蛋白在表3所示的位置或等同位置处结合纤溶酶原的丝氨酸蛋白酶结构域的一个或多个残基。13.如权利要求1至12中任一项所述的抗原结合蛋白，其中该抗原结合蛋白的残基与纤
溶酶原的残基的相互作用由x射线晶体学和0至(包括端值)的接触距离分析定义。14.如权利要求1至13中任一项所述的抗原结合蛋白，其中该抗原结合蛋白与包含含有如SEQ ID NO:8中所示氨基酸序列的VH结构域和含有如SEQ ID NO:7中所示氨基酸序列的VL结构域的抗体结合纤溶酶原上的相同表位，其中该抗原结合蛋白减少或抑制纤溶酶原的激活。15.如权利要求1至3中任一项所述的抗原结合蛋白，其中该抗原结合蛋白在Asp
676
、Arg
677
、Arg
712
、Glu
714
和Asn
769
的位置或等同位置处结合纤溶酶原的丝氨酸蛋白酶结构域的一个或多个残基，优选地，其中本发明的抗原结合蛋白在表4所示的位置或等同位置处结合纤溶酶原的丝氨酸蛋白酶结构域的一个或多个残基。16.如权利要求1至3、14或15中任一项所述的抗原结合蛋白，其中该抗原结合蛋白与包含含有如SEQ ID NO:40中所示氨基酸序列的VH结构域和含有如SEQ ID NO:39中所示氨基酸序列的VL结构域的抗体结合纤溶酶原上的相同表位，其中该抗原结合蛋白减少或抑制纤溶酶原的激活。17.如权利要求1至16中任一项所述的抗原结合蛋白，其中该抗原结合蛋白结合纤溶酶原，并表现出小于15nM、小于10nM或等于约8nM或更小的K
D
。18.如权利要求1至17中任一项所述的抗原结合蛋白，其中该抗原结合蛋白结合纤溶酶原，并表现出大于约1
×
104、大于约1
×
104、或大于或等于约1
×
105或大于或等于约4
×
105的k
a
(M
‑1s
‑1)。19.如权利要求1至18中任一项所述的抗原结合蛋白，其中该抗原结合蛋白结合纤溶酶原，并表现出小于约1
×
10
‑3、小于约5
×
10
‑3、或小于或等于约2
×
10
‑3的k
d
(s
‑1)，或者其中该k
d
小于或等于约7
×
10
‑4。20.如权利要求1至19中任一项所述的抗原结合蛋白，其中该抗原结合蛋白抑制链激酶、tPA或uPA介导的纤溶酶原激活，其IC
50
小于500nM、300nM、250nM、200nM、150nM、100nM、80nM、60nM或50nM，优选约40nM。21.如权利要求1至20中任一项所述的抗原结合蛋白，其中该抗原结合蛋白结合衍生自SEQ ID NO:65中所示氨基酸序列的肽，任选地，其中该抗原结合蛋白结合由SEQ ID NO:65的序列的4、5、7、8、9、10或更多个连续氨基酸残基组成的肽。22.如权利要求1至21中任一项所述的抗原结合蛋白，其中该抗原结合蛋白结合包含以下、基本上由其组成或由其组成的肽：
·
SEQ ID NO:65的554至569残基；
·
SEQ ID NO:65的493至533残基；
·
SEQ ID NO:65的468至525残基；
·
SEQ ID NO:65的554至569残基；
·
SEQ ID NO:65的554至569残基；
·
SEQ ID NO:65的493至533残基，并结合包含SEQ ID NO:65的554至569残基、基本上由其组成或由其组成的肽；
·
SEQ ID NO:65的468至525残基，并结合包含SEQ ID NO:65的554至569残基、基本上由其组成或由其组成的肽。23.如权利要求1至22中任一项所述的抗原结合蛋白，其中该抗原结合蛋白不结合仅包
含该丝氨酸蛋白酶结构域的纤溶酶原或纤溶酶区域，优选地，其中该抗原结合蛋白不结合纤溶酶原或纤溶酶的催化三联体和/或不显著降低纤溶酶的活性。24.如权利要求1至23中任一项所述的抗原结合蛋白，其中该抗原结合蛋白不会显著降低tPA、凝血酶、胰蛋白酶、因子Xa(FXa)和血浆激肽释放酶中任何一种或多种的活性。25.如权利要求1至24中任一项所述的用于结合纤溶酶原的抗原结合蛋白，该抗原结合蛋白包含：FR1
‑
CDR1
‑
FR2
‑
CDR2
‑
FR3
‑
CDR3
‑
FR4以及FR1a
‑
CDR1a
‑
FR2a
‑
CDR2a
‑
FR3a
‑
CDR3a
‑
FR4a其中：FR1、FR2、FR3和FR4各自是框架区；CDR1、CDR2和CDR3各自是互补决定区；FR1a、FR2a、FR3a和FR4a各自是框架区；CDR1a、CDR2a和CDR3a各自是互补决定区；其中这些互补决定区中任一个的序列具有如表1中所述的氨基酸序列，优选地，其中这些框架区具有也如下表1中所述的氨基酸序列，包括特定残基处的氨基酸变化，这种变化可以通过比对衍生自每种抗体的各个框架区来确定。26.如权利要求25所述的抗原结合蛋白，其中CDR1、CDR2和CDR3是来自VH的序列，CDR1a、CDR2a和CDR3a是来自VL的序列，或者其中CDR1、CDR2和CDR3是来自VL的序列，CDR1a、CDR2a和CDR3a是来自VH的序列。27.如权利要求25或26所述的抗原结合蛋白，其中FR1
‑
CDR1
‑
FR2
‑
CDR2
‑
FR3
‑
CDR3
‑
FR4和FR1a
‑
CDR1a
‑
FR2a
‑
CDR2a
‑
FR3a
‑
CDR3a
‑
FR4a通过接头连接，任选地其中该接头是化学物质、一个或多个氨基酸、或两个半胱氨酸残基之间形成的二硫键。28.如权利要求1至27中任一项所述的抗原结合蛋白，其包含以下(按N末端至C末端或C末端至N末端的顺序)的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成：
·
SEQ ID NO:7和8；或
·
SEQ ID NO:39和40。29.如权利要求1至28中任一项所述的抗原结合蛋白，其包含抗体的抗原结合结构域，其中该抗原结合结构域结合或特异性结合纤溶酶原，其中该抗原结合结构域包含以下至少一项：(i)VH，该VH包含含有与SEQ ID NO:4中所示的序列至少约80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％、至少99％相同的序列的互补决定区(CDR)1，含有与SEQ ID NO:5中所示的序列至少约80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％、至少99％相同的序列的CDR2，以及含有与SEQ ID NO:6中所示的序列至少约80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％、至少99％相同的序列的CDR3；(ii)VH，该VH包含与SEQ ID NO:8中所示的序列至少约95％或96％或97％或98％或99％相同的序列；(iii)VL，该VL包含含有与SEQ ID NO:1中所示的序列至少约80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％、至少99％相同的序列的CDR1，含有与SEQ ID NO:2中
所示的序列至少约80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％、至少99％相同的序列的CDR2，以及含有与SEQ ID NO:3中所示的序列至少约80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％、至少99％相同的序列的CDR3；(iv)VL，该VL包含与SEQ ID NO:7中所示的序列至少约95％相同的序列；(v)VH，该VH包含含有SEQ ID NO:4中所示的序列的CDR1，含有SEQ ID NO:5中所示的序列的CDR2，以及含有SEQ ID NO:6中所示的序列的CDR3；(vi)VH，该VH包含SEQ ID NO:8中所示的序列；(vii)VL，该VL包含含有SEQ ID NO:1中所示的序列的CDR1，含有SEQ ID NO:2中所示的序列的CDR2，以及含有SEQ ID NO:3中所示的序列的CDR3；(viii)VL，该VL包含SEQ ID NO:7中所示的序列；(ix)VH，该VH包含含有SEQ ID NO:4中所示的序列的CDR1，含有SEQ ID NO:5中所示的序列的CDR2，以及含有SEQ ID NO:6中所示的序列的CDR3；以及VL，该VL包含含有SEQ ID NO:1中所示的序列的CDR1，含有SEQ ID NO:2中所示的序列的CDR2，以及含有SEQ ID NO:3中所示的序列的CDR3；或(x)VH，该VH包含SEQ ID NO:8中所示的序列；和VL，该VL包含SEQ ID NO:7中所示的序列。30.如权利要求29所述的抗原结合蛋白，其中该抗原结合结构域进一步包含以下至少一项：(i)VH，该VH包含含有与SEQ ID NO:21中所示的序列至少约80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％、至少99％相同的序列的框架区(FR)1，含有与SEQ ID NO:22中所示的序列至少约80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％、至少99％相同的序列的FR2，含有与SEQ ID NO:23中所示的序列至少约80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％、至少99％相同的序列的FR3，以及含有与SEQ ID NO:24中所示的序列至少约80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％、至少99％相同的序列的FR4；(ii)VL，该VL包含含有与SEQ ID NO:17中所示的序列至少约80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％、至少99％相同的序列的FR1，含有与SEQ ID NO:18中所示的序列至少约80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％、至少99％相同的序列的FR2，含有与SEQ ID NO:19中所示的序列至少约80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％、至少99％相同的序列的FR3，以及含有与SEQ ID NO:20中所示的序列至少约80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％、至少99％相同的序列的FR4；(iii)VH，该VH包含含有SEQ ID NO:21中所示的序列的FR1，含有SEQ ID NO:22中所示的序列的FR2，含有SEQ ID NO:23中所示的序列的FR3，以及含有SEQ ID NO:24中所示的序列的FR4；(iv)VL，该VL包含含有SEQ ID...

【专利技术属性】
技术研发人员：J，
申请(专利权)人：莫纳什大学，
类型：发明
国别省市：