一株猪δ冠状病毒强毒株及其在疫苗制备中的应用制造技术

本发明专利技术属于动物病毒学与动物传染病学技术领域，具体涉及一株猪δ冠状病毒强毒株和该毒株在疫苗制备中的应用。本发明专利技术从临床发生腹泻仔猪的小肠内容物中分离到一株PDCoV，命名为猪δ冠状病毒DHeB1株，将其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:V202217，该PDCoV DHeB1具有更高的增殖滴度、更强的致病性和更好的免疫原性，可用于制备PDCoV灭活疫苗。PDCoV灭活疫苗。PDCoV灭活疫苗。

【技术实现步骤摘要】
一株猪
δ
冠状病毒强毒株及其在疫苗制备中的应用


[0001]本专利技术属于动物病毒学与动物传染病学
具体涉及一株猪δ冠状病毒强毒株和该毒株在疫苗制备中的应用。

技术介绍

[0002]猪δ冠状病毒(PorcineDeltacoronavirus,PDCoV)属于冠状病毒科、δ冠状病毒属，由中国香港学者于2011年从猪粪便中检测到，但当时并未对其进行深入的研究，也未说明其临床意义。2014年，美国俄亥俄州的猪场首次暴发PDCoV感染，并迅速蔓延到20多个州。至此，PDCoV开始受到研究者的关注。随后，韩国、加拿大、中国、越南、老挝、泰国等10多个国家或地区相继报道了PDCoV感染的发生与流行。目前，PDCoV感染在多个养猪国家广泛存在，给养世界猪业造成了较大的经济损失。
[0003]PDCoV对不同品种和日龄的猪均易感，但对仔猪的危害最大，感染仔猪主要表现为呕吐、腹泻、脱水甚至死亡，其它日龄猪感染后临床症状较轻或呈隐性感染。但泰国学者在2015年报道的病例证实PDCoV感染不仅能导致新生仔猪的大量死亡(死亡率高达64.27％)，而且也能导致母猪的死亡(死亡率为27.63％)，引起世界养猪业的高度关注(Janetanakitetal.PorcineDeltacoronavirus,Thailand,2015.EmergInfectDis,2016,22:757
‑
759.)。
[0004]最近的研究发现，PDCoV除了感染猪以外，还可以感染鸡、牛、小鼠、火鸡，甚至可以感染人，是一种潜在的人兽共患病病原。但目前尚无针对该病的疫苗和特效药物，因此开展病毒的分离鉴定和疫苗的制备对预防和控制PDCoV感染十分重要。
[0005]申请公布号为CN110747175A的中国专利技术专利申请，从猪肠道组织中分离，并经传代纯化获得一株猪δ冠状病毒PDC
‑
SX19，其微生物保藏号为CGMCCNo.18332。该分离株能够在传代细胞上稳定增殖，产生典型细胞病变。虽然该猪δ冠状病毒分离株具有优异的免疫原性，采用该分离株制备的疫苗能够诱导仔猪产生中和抗体，但是该猪δ冠状病毒株致病力低，并不是制备PDCoV灭活疫苗的优选毒株。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供一株猪δ冠状病毒强毒株DHeB1株，该毒株具有较高的增殖滴度、致病性和免疫原性。
[0007]本专利技术的另一个目的在于提供PDCoVDHeB1株用于制备猪δ冠状病毒疫苗，所述疫苗优选为灭活疫苗。
[0008]为了达到上述目的，本专利技术采取以下技术措施：从临床发生腹泻仔猪的小肠内容物中分离到一株PDCoV，命名为猪δ冠状病毒DHeB1株，将该猪δ冠状病毒强毒株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:V202217。经与专利技术人所在实验室分离的另两株PDCoV(DHN株和DJX株)以及现有的PDCoV进行比较，发现PDCoVDHeB1具有更高的增殖滴度、更强的致病性和更好的免疫原性，是制备
PDCoV灭活疫苗的优选毒株。该毒株的分离鉴定过程如下：1.猪δ冠状病毒DHeB1株的分离鉴定：无菌收集经RT
‑
PCR检测为PDCoV阳性的仔猪小肠内容物，处理后接种LLC
‑
PK1细胞单层，经细胞病变观察、RT
‑
PCR检测和间接免疫荧光 (IFA)检测证实获得PDCoV，将其命名为PDCoV DHeB1株。
[0009]2.猪δ冠状病毒DHeB1株在细胞中的增殖能力：分别测定PDCoV DHeB1株第6 代、第11代和第15代病毒的TCID
50
，并与专利技术人所在实验室之前分离的PDCoV DHN株和DJX株(均为2020年分离)第11代毒的TCID
50
进行比较。发现本专利技术的PDCoVDHeB1株第11代毒的平均TCID
50
为10
7.8
/mL，明显高于PDCoV DHN株和DJX株第11代毒的TCID
50
(分别为10
7.0
/mL和10
7.3
/mL)。
[0010]3.猪δ冠状病毒DHeB1株对仔猪的致病性：将PDCoV DHeB1和DHN株及DJX株以相同的剂量分别经口服感染5日龄健康仔猪，通过临床症状和病理变化观察对3株病毒的致病性进行比较分析。结果发现PDCoV DHeB1能引起所有感染仔猪发生腹泻、小肠肠壁变透明、变薄，小肠内充满水样液体，并最终死亡，而另两株病毒感染的仔猪虽有不同程度的发病，但其症状和病理变化明显轻于PDCoV DHeB1株感染仔猪，说明PDCoV DHeB1株对仔猪的致病性明显高于PDCoV DHN株和DJX株。
[0011]4.猪δ冠状病毒灭活疫苗的制备与评价：将PDCoV DHeB1、DHN株和DJX株第11 代毒的病毒含量均调整为10
7.0
TCID
50
/mL，加入甲醛灭活后，分别与Montanide ISA 201混合后乳化制成灭活疫苗，经检验合格后对其安全性进行评价，结果显示3种疫苗以1mL/头单剂量接种、2mL/头单剂量接种和1mL/头单剂量2次接种对仔猪均是安全的。免疫原性检测显示PDCoV DHeB1株灭活疫苗诱导的PDCoV中和抗体明显高于PDCoV DHN株和DJX 株，并以DHN株诱导的中和抗体水平最低。说明PDCoV DHeB1株具有最好的免疫原性。
[0012]本专利技术的有益效果为：本专利技术成功分离了一株致病性强的猪δ冠状病毒，命名为PDCoV DHeB1株，该毒株的增殖滴度高，免疫原性好，可用于制备灭活疫苗，有效预防临床PDCoV感染。其中，本专利技术的PDCoV DHeB1株在首免后14天的中和抗体水平达到了1:32，在首免后66天诱导的中和抗体水平最高可达1:656，表明本专利技术分离的PDCoV DHeB1株具有优异的免疫原性。
附图说明
[0013]图1为PDCoV DHeB1株第11代接种LLC
‑
PK1细胞产生的细胞病变。图中，A为未接种病毒的正常细胞对照，B为DHeB1株第11代接种细胞12h产生的细胞病变，C为 DHeB1株第11代接种细胞24h产生的细胞病变。
[0014]图2为PDCoV DHeB1株PCR鉴定检测结果。图中，M：DL2000 Marker；1： PDCoV DHeB1；2：阴性对照。
[0015]图3为PDCoV DHeB1株IFA鉴定检测结果。
[0016]图4为仔猪攻毒后临床观察结果。图中，A为PDCoV DHeB1株攻毒仔猪，B为 PDCoV DHN株攻毒仔猪，C为PDCoV DJX株攻毒仔猪，D为未攻毒仔猪。
[0017]图5为仔猪攻毒后剖检观察结果。图中，A为PDCoV DHeB1株攻毒仔猪小肠，B为PDCoV DHN株攻毒仔猪小肠，C为PDCoV DJX株攻毒仔猪小肠，D为未攻毒仔猪小本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一株猪δ冠状病毒强毒株，其特征在于，所述猪δ冠状病毒强毒株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:V202217，分类命名：猪δ冠状病毒DHeB1株。2.权利要求1所述的一株猪δ冠状病毒强毒株在制备猪δ冠状病毒疫苗中的应用。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述疫苗为灭活疫苗。4.一种用于预防猪δ冠状病毒的疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物包括免疫量的权利要求1所述的猪δ冠状病毒强毒株或其培养物的灭活抗原和药学上可以接受的载体。5.根据权利要求4所述的一种用于预防猪δ冠状病毒的疫苗组合物，其特征在于，所述猪δ冠状病毒强毒株或其培养物的灭活抗原为猪δ冠状病毒强毒株全病毒灭活抗原。6.根据权利要求5所述的一种用于预防猪δ冠状病毒的疫苗组合物，其特征在于，灭活前病毒含量为10
7.0
TCID
50
/m...

【专利技术属性】
技术研发人员：方六荣，肖少波，方谱县，周艳荣，马俊，卢佑新，彭旋，张誉瀚，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：