一种弧菌噬菌体及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种弧菌噬菌体及其应用，属于海洋生物工程领域。该噬菌体保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏号为：CCTCC NO：M 2022200，保藏日期为：2022年03月04日，保藏地址为：中国武汉市武汉大学，邮编：430072，分类命名为Vibrio neocaledonicus phage vB_Vne

A Vibrio bacteriophage and its application

【技术实现步骤摘要】
一种弧菌噬菌体及其应用


[0001]本专利技术涉及海洋生物工程领域，特别是一种弧菌噬菌体及其应用。

技术介绍

[0002]水产养殖业是我国重要的农业活动之一，能够为全国提供优质的食粮，总蛋白贡献约为30%，同时为医药、化工、饲料等产业发展提供大量原料等。
[0003]在水产养殖活动中，弧菌病害是水产养殖的重要灾害之一。弧菌是一类革兰氏阴性，具有极生鞭毛，能运动，无芽胞和荚膜的短杆状细菌，其中有的弧菌有一定的弯曲，呈弧状或逗点状。部分弧菌是各种海洋生物的重要致病菌，引起的弧菌病流行面积广，发病率高。目前，已发现的对水产养殖鱼虾类具有致病性的弧菌有十几种，主要是副溶血弧菌、溶藻弧菌、鳗弧菌和哈维氏弧菌等，同时，也有部分弧菌对哺乳动物特别是人类具有致病性。弧菌病已经成为水产养殖业病害的最主要拦路虎，甚至达到“谈弧色变”的程度。弧菌在水产养殖中是长期存在的，将弧菌控制在一定的数量内是不需要处理的，但如果受到环境、水草、有害菌的影响就可能会刺激弧菌的迅速繁殖，污染水体，侵害养殖生物。
[0004]以2020年春为例，我国对虾苗种场出现严重的“玻璃苗”现象，该疾病首先在南方苗种场呈现爆发性趋势，并逐步在北方沿海一代蔓延，导致我国春季虾苗供应严重不足。4
‑
6月份，中国水产科学研究院黄海水产研究所对5家育苗场共10个单元的养殖水体和虾苗胰腺组织进行检测，发现新喀里多尼亚弧菌（vibrio neocaledonicus）的检出率最高，室内人工感染表明其致病性很强，而且能够对常用的抗生素如利福平、吡哌酸、链霉素、多粘霉素、青霉素、复方新诺明等有明显的耐药性。
[0005]弧菌病害防治一直是水产研究的重点。由于抗生素滥用，耐药细菌大量出现与流行，尤其近年来出现了一些“超级病菌”，它们几乎对所有的抗生素都不敏感，导致人类和动物对此类细菌的感染几乎无药可用，因此非常迫切需要新的抗感染武器来替代抗生素。在此背景下，人类把目光投向了噬菌体治疗。噬菌体作为一种新兴的微生态抗菌剂，因其具有替代抗生素治疗疾病的潜在可能，已受到越来越多的关注。许多研究表明，噬菌体用于治疗弧菌病取得了良好效果，例如在哈维氏弧菌存在的条件下使用噬菌体治疗的幼虾组存活率相较于空白对照组由10%提高到了40%；Stalin等研究证实了在水产养殖系统中应用噬菌体可以作为预防和治疗对虾副溶血弧菌病的有效方式；Li等运用“鸡尾酒疗法”将3株噬菌体等比例混合后用于治疗海参灿烂弧菌病的效果优于单株；Sasikala等研究的噬菌体可以裂解 6 株溶藻弧菌，能有效控制溶藻弧菌的数量。而且，噬菌体有严格的宿主特异性，不会感染其他种属的生物（包括养殖生物），所以不会对除了其侵染对象以外的其他生物死亡，因此具有专一性和安全性。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的之一是提供一种弧菌噬菌体；目的之二是提供一种该噬菌体的应用，以弥补现有技术的不足。
[0007]为实现上述技术目的，本专利技术采用的技术方案为：一种弧菌噬菌体，保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏号为：CCTCC NO：M 2022200，保藏日期为：2022年03月04日，保藏地址为：中国武汉市武汉大学，邮编：430072，分类命名为Vibrio neocaledonicus phage vB_Vne
‑
09SG01。
[0008]所述噬菌体是一株能够特异性裂解新喀里多尼亚弧菌（Vibrio neocaledonicus）的长尾噬菌体，尾部长141
±
5 nm，头部约为81
±
2 nm左右的正二十面体；该噬菌体NF的潜伏期约为40 min，裂解期约为60 min；该噬菌体在pH 5
‑
9、0
‑
33.0
‰
、≤32℃下均能保持活性的相对稳定。
[0009]所述噬菌体（vB_Vne
‑
09SG01）在10
5 PFU/mL即达到较好的杀菌效果，在6 h内即可杀灭≥90%的弧菌；建议低温储存，但即使在32℃条件下处理24 h后仍有54.4%的噬菌体存活；最适pH为7
‑
8，符合大部分海水养殖条件；对盐度的耐受性较广，适宜在盐度26.4
‑
33.0
‰
条件下应用，在0
‰
的淡水条件下也有52.5%的噬菌体存活，即能够应用于河口至海水等养殖环境。
[0010]一种噬菌体制剂，包括其中噬菌体（vB_Vne
‑
09SG01），且总噬菌体有效量≥10
5 PFU/mL；或是该制剂混合其他对该弧菌有抑制作用的试剂使用。
[0011]其中，上述制剂中，辅料为SM缓冲液、无菌海水等一种或多种；所述SM缓冲液包括10 mM Tris
‑
HCl、100 mM NaCl、10 mM MgSO4，pH 7.8。
[0012]所述噬菌体的分离方法包括以下步骤：将0.22μm的海水与培养至对数期的弧菌混合，继续培养至7天，在第1、3、7天分别采用双层平板法进行噬菌体分离。挑选单个噬菌斑，并继续采用双层平板法对噬菌体进行了纯化，共纯化5次，后进行富集得到噬菌体悬浮液。然后经过渐次扩大培养、多次离心、PEG 8000沉淀、氯化铯密度梯度离心净化、染色后，采用透射电子显微镜观察，鉴定此噬菌体为长尾噬菌体。
[0013]所述噬菌体（vB_Vne
‑
09SG01）在裂解新喀里多尼亚弧菌（vibrio neocaledonicus）中的应用；具体能够应用到防治海产贝类应对新喀里多尼亚弧菌（vibrio neocaledonicus）的侵染中，或应用到水环境中对新喀里多尼亚弧菌（vibrio neocaledonicus）进行杀灭。
[0014]进一步的，所述噬菌体（vB_Vne
‑
09SG01）及其制剂对新喀里多尼亚弧菌（vibrio neocaledonicus）进行杀灭的终浓度为≥10
5 PFU/mL。
[0015]所述噬菌体能够用于致病弧菌的药物制备中，尤其是新喀里多尼亚弧菌引起的病症的药物制备中。
[0016]本专利技术的有益效果在于：（1）采用该噬菌体特异性杀灭能够导致贝类死亡和摄食量降低的新喀里多尼亚弧菌（vibrio neocaledonicus），同样也能够侵染其他2种新喀里多尼亚弧菌，具有有效的应用价值。
[0017]（2）该噬菌体分离自海水环境，效果持久稳定，个别辅助试剂也均属于无毒无害化学物，不会对养殖生物和环境产生影响，无毒无害，安全环保。
[0018]（3）该噬菌体对新喀里多尼亚弧菌（vibrio neocaledonicus）具有迅速且持久的杀灭效果，而且能够显著提高侵染后贝类的摄食量，因此可以作为药物应用于该弧菌引发
的贝类死亡等。
附图说明
[0019]图1 为实施例中噬菌体（vB_Vne
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种弧菌噬菌体，其特征在于，该噬菌体保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏号为：CCTCC NO：M 2022200，保藏日期为：2022年03月04日，保藏地址为：中国武汉市武汉大学，邮编：430072，分类命名为Vibrio neocaledonicus phage vB_Vne
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09SG01。2.如权利要求1所述的噬菌体，其特征在于，所述噬菌体是一株能够特异性裂解新喀里多尼亚弧菌的长尾噬菌体，尾部长141
±
5 nm，头部为81
±
2 nm的正二十面体；该噬菌体NF的潜伏期约为40 min，裂解期为60 min；该噬菌体在pH 5
‑
9、盐度0
‑
33.0
‰
、温度≤32℃下均能保持活性的稳定。3.一种噬菌体制剂，其特征在于，该制剂包括权利要求1所述的噬菌体，且总噬菌体有效量≥105 PFU/mL。4.如权利要求3所述的噬菌体制剂，其特征在于，所述制剂中，辅料为SM缓冲液、无菌海水一种或多种混合。5.权利要求1所述的噬菌体的分离方法，...

【专利技术属性】
技术研发人员：常丽荣，卢龙飞，姚艳艳，胡晓丽，史娇霞，孔祥福，
申请(专利权)人：威海长青海洋科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：