用于扩增GJB2基因和SLC26A4基因的引物组、试剂盒和方法技术

本发明专利技术提出了一种引物组，所述引物组包括：48对引物，所述48对引物具有如SEQ IDNO：1～96所示的核苷酸序列。利用本发明专利技术的引物组通过两个反应即可扩增GJB2基因和SLC26A4基因的全编码区域，且根据引物组上的标签数量可实施多样本加到一个反应管中同时建库，可以一次同时检测上百甚至上千个样本，通量高并可规范操作，适用于非诊断目的的耳聋基因检测。适用于非诊断目的的耳聋基因检测。

【技术实现步骤摘要】
用于扩增GJB2基因和SLC26A4基因的引物组、试剂盒和方法


[0001]本专利技术涉及生物领域。具体地，本专利技术涉及用于扩增GJB2基因和SLC26A4基因的引物组、试剂盒和方法。

技术介绍

[0002]目前，测序方法主要有如下几种：
[0003](1)目标区域捕获测序：
[0004]目标区域测序(Target Region Sequencing,TRS)是根据感兴趣的基因组区域设计特异性探针，与基因组DNA进行液相杂交，将目标基因组区域的DNA片段进行富集后再利用第二代测序技术进行测序的研究策略。例如Agilent SureSelect Target Enrichment System液相捕获，是基于120mer的RNA寡核苷酸探针或者叫“baits”。Baits上连接的生物素，可以被链霉亲和素标记的磁珠吸附。打断后的基因组片段，与baits进行杂交，捕获目标片段。利用磁珠吸附出带有baits的DNA片段后，进行磁珠洗脱、RNA探针降解，最终获得目标区域DNA片段。
[0005](2)飞行时间质谱技术：
[0006]基于时间飞行质谱(MALDI
‑
TOF)检测SNP(目标位点)原理如下：首先通过PCR扩增出含有SNP位点的一段DNA(SNP位点前后各50bp左右)，然后用SAP酶去除掉PCR体系中剩余的脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)和引物，然后加入一单碱基延伸引物，其3
’
末端碱基紧挨SNP位点，采用四种ddNTP替代dNTP。这样，探针在SNP位点处仅延伸一个碱基，连接上的ddNTP与SNP位点的等位基因对应。用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI
‑
TOF MS)检测延伸产物与未延伸引物间的分子量差异，确定该点处碱基。
[0007](3)Sanger测序技术：
[0008]利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物，直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3
‑
OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止。终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始点，终止点由反应中相应的双脱氧而定。
[0009]采用上述几种测序方法存在如下缺点：
[0010]目标区域捕获测序：实验流程复杂，建库时间长，通量低，成本高。
[0011]飞行时间质谱技术：主要适用SNP分型检测，不适用于对某个基因组区域的每个位点的检测。
[0012]Sanger测序：一个反应只能对应检测一个目标区域，通量低，成本较高。
[0013]多重聚合酶链反应(PCR)是在同一个反应体系中加入不同的引物对，针对不同的模板或同一模板的不同区域进行特异性的扩增，从而得到多个目的片段。自1988年首次提出这个概念以来，该方法已成功应用于许多领域的DNA检测，包括基因缺失检测、多态性分
析、定量分析和逆转录聚合酶链反应(RT
‑
PCR)等。将用于检测不同目的片段的多重PCR结合在一起，实现了对同一反应体系的同步检测，克服了成本高的缺点，并提高该测试的诊断能力。对于某些病原微生物、某些遗传病、癌基因等，型别比较多，多重PCR技术可提高其检出率，并鉴定其型别及突变等。多重PCR技术能够同时对多个目标区域进行检测，大幅提升检测效率的和能降低检测成本，因此得到广泛的应用。
[0014]耳聋是人类最常见的疾病，在新生儿发病率为1
‰
至31
‰
，随着年龄增长，耳聋患病率逐渐增高。在由遗传因素导致的耳聋患者中(约50％)，其中非综合征型耳聋为70％，综合征型耳聋为30％。非综合征性遗传性耳聋中，80％为常染色体隐性遗传(AR)，15％
‑
20％为常染色体显性遗传(AD)，1％为X连锁或线粒体遗传。与非综合征型耳聋相关的最常见基因是GJB2基因，该基因占所有AR非综合征型耳聋的50％，占所有先天性耳聋的20％。SLC26A4基因被认为是AR非综合征性耳聋第二常见基因，仅次于GJB2基因。已经报道了超过500种不同的SLC26A4突变，每个民族都有自己特有的突变。另外与SLC26A4基因隐性突变相关的Pendred综合征是最常见的遗传性感音神经性耳聋综合征，约90％的Pendred综合征患者含有SLC26A4的致病突变。选择耳聋最常见的基因GJB2和SLC26A4进行检测，利用一种低成本通量高的检测技术鉴定基因状态，不仅可以辅助临床明确病因，而且还可以给耳聋高危人群或孕前人群进行生育指导。对于耳聋基因检测普及和推广具有重要意义。
[0015]然而，目前通过多重PCR技术同时对GJB2基因和SLC26A4基因进行扩增检测的方法仍有待研究。

技术实现思路

[0016]本专利技术旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。为此，本专利技术提出了引物组和试剂盒及其用途、非诊断目的扩增或检测GJB2基因和SLC26A4基因的方法、构建文库的方法、测序文库和测序方法，利用该引物组通过两个反应即可扩增GJB2基因和SLC26A4基因的全编码区域，且根据引物组上的标签数量可实施多样本加到一个反应管中同时建库，可以一次同时检测上百甚至上千个样本，通量高并可规范操作，适用于非诊断目的的耳聋基因检测。
[0017]为此，在本专利技术的一个方面，本专利技术提出了一种引物组。根据本专利技术的实施例，所述引物组包括：48对引物，所述48对引物具有如SEQ ID NO：1～96所示的核苷酸序列。根据本专利技术实施例的引物组可以分为两组，分别进行一步多重PCR反应，即可特异性扩增GJB2基因和SLC26A4基因的全编码区域，从而可适用于对上述两个基因的科学研究和耳聋基因的非诊断目的检测。
[0018]根据本专利技术的实施例，上述引物组还可以具有下列附加技术特征：
[0019]根据本专利技术的实施例，所述48对引物中的每条引物的5
’
端进一步含有标签序列。
[0020]在本专利技术的又一方面，本专利技术提出了前面所述引物组在扩增或检测GJB2基因和SLC26A4基因中的用途。如前所述，根据本专利技术实施例的引物组可以特异性扩增GJB2基因和SLC26A4基因的全编码区域，从而实现上述两个基因的检测，可应用于科学研究和疾病的筛查诊断，例如耳聋疾病。
[0021]在本专利技术的又一方面，本专利技术提出了前面所述引物组在制备试剂盒中的用途。根据本专利技术的实施例，所述试剂盒用于扩增或检测GJB2基因和SLC26A4基因。如前所述，根据
本专利技术实施例的引物组可以特异性扩增GJB2基因和SLC26A4基因的全编码区域，从而实现上述两个基因的检测。
[0022]根据本专利技术的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种引物组，其特征在于，包括：48对引物，所述48对引物具有如SEQ ID NO：1～96所示的核苷酸序列。2.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，所述48对引物中的每条引物的5
’
端进一步含有标签序列。3.权利要求1或2所述引物组在扩增或检测GJB2基因和SLC26A4基因中的用途。4.权利要求1或2所述引物组在制备试剂盒中的用途，其特征在于，所述试剂盒用于扩增或检测GJB2基因和SLC26A4基因；任选地，所述试剂盒用于筛选携带耳聋基因突变的生物样本。5.一种试剂盒，其特征在于，含有权利要求1或2所述引物组。6.一种非诊断目的扩增或检测GJB2基因和SLC26A4基因的方法，其特征在于，包括：以权利要求1或2所述引物组或权利要求5所述试剂盒中的引物组作为引物，对DNA片段进行多重PCR扩增。7.根据权利要求6所述方法，其特征在于，基于25μ...

【专利技术属性】
技术研发人员：彭智宇，向嘉乐，罗红玉，
申请(专利权)人：深圳华大基因股份有限公司，
类型：发明
国别省市：