牙鲆卵原干细胞培养液及牙鲆卵原干细胞体外培养方法及应用技术

本发明专利技术提供了一种牙鲆卵原干细胞培养液及牙鲆卵原干细胞体外培养方法及应用，涉及生物技术领域。所述培养液包含以下成分：10％

Culture medium of Paralichthys olivaceus ovogonial stem cells and in vitro culture method and application of Paralichthys olivaceus ovogonial stem cells

【技术实现步骤摘要】
牙鲆卵原干细胞培养液及牙鲆卵原干细胞体外培养方法及应用


[0001]本专利技术涉及生物
，尤其是涉及一种牙鲆卵原干细胞培养液及牙鲆卵原干细胞体外培养方法及应用。

技术介绍

[0002]鱼类卵原干细胞(Oogonia stem cells，OSCs)是存在于卵巢中的生殖干细胞，具有自我更新和分化能力，最终通过分化产生的卵子将遗传信息传递给下一代。卵原干细胞存在鱼类整个发育周期，但随着性腺发育，其数量有所减少。获得较大数量和较高比例的卵原干细胞不仅有利于开展生殖相关基因的机理研究，而且有助于通过“借腹生子”技术产生雌鱼的子代，达到种质资源保护和良种选育的目的。
[0003]虽然部分鱼类卵原细胞相关研究见诸文献报道，但是从新鲜组织中分离出来的卵原细胞的量有限，限制了其更广泛的应用。如果在体外建立稳定卵原干细胞系，进行扩大培养，不仅可为生殖干细胞移植提供大量的供体来源的细胞，有效提高生殖干细胞移植成功率，而且还可以为鱼类基因组学和病毒学的研究提供一个良好的平台。
[0004]然而，卵原干细胞的体外培养相关研究非常少，在海水鱼中也仅建立了几个以体细胞为主的卵巢细胞系。因此，有必要研发一种卵原干细胞长期体外培养方法。
[0005]鉴于此，特提出本专利技术。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供一种牙鲆卵原干细胞培养液及牙鲆卵原干细胞体外培养方法及应用。本专利技术通过摸索牙鲆卵原干细胞的体外培养条件，提供了适于卵原干细胞的培养液并建立了卵原干细胞体外稳定传代的培养方法，最终获得了比例较高的卵原干细胞，并提供了全方面鉴定卵原干细胞的方法，同时本专利技术开展了卵原干细胞在外源基因表达研究、病毒感染或种质资源保护等方面的应用。
[0007]本专利技术提供的技术方案如下：
[0008]在一个方面，本专利技术提供了一种牙鲆卵原干细胞培养液，所述培养液包含以下成分：10％
‑
15％(v/v)的FBS，0.9％
‑
1.2％(v/v)的牙鲆血清，80
‑
120μmol/L的β
‑
巯基乙醇，380
‑
450U/mL的青霉素，0.35
‑
0.50mg/mL的链霉素，0.8
‑
1.3μg/mL的两性霉素B，1.5
‑
2.5ng/mL的bFGF以及1.5
‑
2.5ng/mL的LIF。
[0009]在一个实施方案中，所述培养液还包含缓冲液，所述缓冲液选自HEPES、NaHCO3缓冲液，优选HEPES缓冲液；所述缓冲液浓度为8
‑
11mmol/L。
[0010]在一个实施方案中，所述培养液中的基础培养基包括L15、M199、MEM、DMEM、DMEM/F12，优选L15。
[0011]本专利技术摸索优化了卵原干细胞的体外培养液，通过在L15或M199或MEM或DMEM或DMEM/F12基础培养基中添加10％
‑
15％(v/v)的FBS，0.9％
‑
1.2％(v/v)的牙鲆血清，80
‑
120
μmol/L的β
‑
巯基乙醇，380
‑
450U/mL的青霉素，0.35
‑
0.50mg/mL的链霉素，0.8
‑
1.3μg/mL的两性霉素B，1.5
‑
2.5ng/mL的bFGF以及1.5
‑
2.5ng/mL的LIF作为原代培养液，使得本专利技术的培养液更加适合用于进行卵原干细胞的原代培养。
[0012]在另一个方面，本专利技术提供了一种牙鲆卵原干细胞体外培养方法，所述方法包括以下步骤：
[0013](a)卵原干细胞的原代培养：将经分离纯化获得的牙鲆卵原干细胞接种于前述培养液的培养瓶中进行原代培养；
[0014](b)卵原干细胞的传代培养：当所述培养瓶中细胞长满全瓶后，吸弃旧培养液，按照1：2
‑
3的比例加入传代培养液进行传代；
[0015](c)分离获得纯化的卵原干细胞系并进行鉴定。
[0016]本专利技术的方法建立了可持续传代的牙鲆卵原干细胞系，成功率高、细胞增殖传代能力强的优点。
[0017]在一个实施方案中，步骤(b)中，所述传代培养液包括以下成分：12％
‑
18％(v/v)的FBS，0.9％
‑
1.2％(v/v)的牙鲆血清，80
‑
120μmol/L的β
‑
巯基乙醇，90
‑
110U/mL的青霉素，0.08
‑
0.12mg/mL的链霉素，0.2
‑
0.3μg/mL的两性霉素B，1.5
‑
2.5ng/mL的bFGF、1.5
‑
2.5ng/mL的LIF以及8
‑
11mmol/L的HEPES缓冲液。
[0018]在一个实施方案中，步骤(b)中，所述传代培养液包括以下成分：14％
‑
16％(v/v)的FBS，1％
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1.1％(v/v)的牙鲆血清，90
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110μmol/L的β
‑
巯基乙醇，95
‑
105U/mL的青霉素，0.09
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0.11mg/mL的链霉素，0.25
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0.35μg/mL的两性霉素B，1.8
‑
2.2ng/mL的bFGF、1.8
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2.2ng/mL的LIF以及9
‑
10mmol/L的HEPES缓冲液。
[0019]本专利技术通过在L15或M199或MEM或DMEM或DMEM/F12基础培养基中添加12％
‑
18％的FBS，0.9％
‑
1.2％的牙鲆血清，80
‑
120μmol/L的β
‑
巯基乙醇，90
‑
110U/mL的青霉素，0.08
‑
0.12mg/mL的链霉素，0.2
‑
0.3μg/mL的两性霉素B，1.5
‑
2.5ng/mL的bFGF、1.5
‑
2.5ng/mL的LIF以及8
‑
11mmol/L的HEPES缓冲液作为传代培养液，获得目标牙鲆卵原干细胞率高，卵原干细胞比例比现有技术达到了较高的水平。
[0020]在一个实施方案中，所述培养方法的培养温度为11
‑
29℃，优选15
‑
25℃，最优选23℃。
[0021]在一个实施方案中，步骤(a)中，分离纯化的方法包括加入包含0.25％(m/m)Trpsin、0.055％(m/m)DNaseI、5％(v/v)FBS的胰酶消化工作液消化3h，经过Percoll梯度离心获得纯本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种牙鲆卵原干细胞培养液，其特征在于，所述培养液包含以下成分：10％
‑
15％的FBS，0.9％
‑
1.2％的牙鲆血清，80
‑
120μmol/L的β
‑
巯基乙醇，380
‑
450U/mL的青霉素，0.35
‑
0.50mg/mL的链霉素，0.8
‑
1.3μg/mL的两性霉素B，1.5
‑
2.5ng/mL的bFGF以及1.5
‑
2.5ng/mL的LIF。2.根据权利要求1所述的培养液，其特征在于，所述培养液还包含缓冲液，所述缓冲液选自HEPES、NaHCO3缓冲液，优选HEPES缓冲液；所述缓冲液的浓度为8
‑
11mmol/L。3.根据权利要求2所述的培养液，其特征在于，所述培养液中的基础培养基包括L15、MEM、DMEM、DMEM/F12、M199，优选L15。4.一种牙鲆卵原干细胞体外培养方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(a)卵原干细胞的原代培养：将经分离纯化获得的牙鲆卵原干细胞接种于含权利要求1
‑
3中任一项所述培养液的培养瓶中进行原代培养；(b)卵原干细胞的传代培养：当所述培养瓶中细胞长满全瓶后，吸弃旧培养液，按照1：2
‑
3的比例加入传代培养液进行传代；(c)分离获得纯化的卵原干细胞系并进行鉴定。5.根据权利要求4所述的体外培养方法，其特征在于，步骤(b)中，所述传代培养液包括以下成分：12％
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18％的FBS，0.9％
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1.2％的牙鲆血清，80
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120μmol/L的β
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巯基乙醇，90
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110U/mL的青霉素，0.08
‑
0.12...

【专利技术属性】
技术研发人员：任玉芹，侯吉伦，王桂兴，王玉芬，张祎桐，孙朝娣，贺暖，刘玉峰，何忠伟，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院北戴河中心实验站，
类型：发明
国别省市：