一株枯草芽胞杆YX72及其在防治烟草镰刀菌根腐病和促生长中的应用制造技术

本发明专利技术涉及微生物应用领域，具体涉及一种枯草芽胞杆YX72及其在防治烟草镰刀菌根腐病和促生中的应用，包括枯草芽胞杆YX72的筛选和分析测定方法，枯草芽胞杆YX72在防治烟草镰刀菌根腐病和促生长中的应用。本发明专利技术筛选出一种烟草尖孢镰刀菌和茄病镰刀菌具有良好的拮抗作用，对多种常见烟草病原真菌抑菌具有较强的抑制效果，对烟草种子萌发及促生作用效果好，对靶标病原菌尖孢镰刀菌的菌丝生长具有显著抑制作用，对镰刀菌根腐病的盆栽防效及生防菌促生作用效果好的枯草芽胞杆YX72及其在防治烟草镰刀菌根腐病和促生中的应用，使得本发明专利技术具有广泛的市场前景。具有广泛的市场前景。具有广泛的市场前景。

A Bacillus subtilis spore stalk yx72 and its application in controlling tobacco Fusarium mycorrhizal rot and promoting growth

【技术实现步骤摘要】
一株枯草芽胞杆YX72及其在防治烟草镰刀菌根腐病和促生长中的应用


[0001]本专利技术涉及微生物应用领域，具体涉及一种枯草芽胞杆YX72及其在防治烟草镰刀菌根腐病和促生中的应用。

技术介绍

[0002]病害一直是影响烟草生产的重要因素之一，近年来随着气候条件、土壤微生态和耕作制度等变化，烟草镰刀菌根腐病已成为危害烟草的重要根茎类真菌病害(李小杰等，2022)，引起烟草镰刀菌根腐病的主要病原是尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)和茄病镰刀菌(Fusarium solani)(邱睿等，2018)。目前防治作物镰刀菌根腐病的主要策略是利用抗病品种和化学防治，但抗病种植资源有限、选育抗病品种周期长，化学防治主要是通过化学杀菌剂来杀死或抑制病原菌生长达到防治效果，长期使用化学药剂会造成环境污染、农药残留、病原菌产生抗药性等问题(邱睿等2016)，长期大量使用化学农药还可加速病菌群体遗传结构生理分化和变异(程海洋等，2021)。近年来，植物病害的防治已由化学防治逐渐向生物防治转变，生防微生物的应用成为防治植物病虫害的重要手段，利用拮抗菌防治烟草病害已有相关报道(赵誉强等，2022)。针对烟草镰刀菌根腐病生防菌研究较多的是木霉菌(Trichoderma spp.)。
[0003]2021年从豫中烟区烟草根际土壤中分离筛选出对烟草尖孢镰刀菌具有拮抗作用的棘孢木霉(Trichoderma asperellum)Tr
‑
0111；2015年通过平板稀释法从洛阳地区烟田土壤中获得对尖孢镰刀菌具有较好拮抗效果的哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、棘孢木霉、深绿木霉(Trichoderma atroviride)和毛簇木霉(Trichoderma viride)；2020年通过平板对峙筛选出对烟草镰刀菌根腐病病原菌具拮抗作用的两种木霉菌，粗壮木霉(Trichoderma strigosum)和钩状木霉(Trichoderma hamatum)；2019年从烟草根际土壤中分离筛选出对烟草尖孢镰刀菌具有较强抑制作用的放线菌金黄垂直链霉菌(Streptomyces aureoverticillatus)； 2020年通过平板对峙试验结果表明贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)和枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)对木香尖孢镰刀菌的抑菌率均达到66％以上；2019年研究发现生防细菌 JK2015对菌尖孢镰刀菌茄子专化型(Fusarium oxysporum f.sp.melongenae，Fom)和尖孢镰刀菌古巴专化型4号小种(Fusarium oxysporum f.sp.cubense race 4，Foc4)抑菌效果显著，抑菌率达到52％以上；由此可见，目前关于烟草镰刀菌根腐病生防细菌相关研究相对较少，为筛选出对烟草镰刀菌根腐病病原菌有高效拮抗效果的生防细菌，本专利技术以豫中和豫西烟区健康烟株根际土壤为分离来源，利用平板对峙法对分离菌株的拮抗效果进行筛选，对抑菌率较高的菌株进行抑菌谱测定、防病促生作用测定、分类鉴定以及生防机理探索，以研发烟草为烟草镰刀菌根腐病生物防治药剂。

技术实现思路

[0004]本专利技术提供枯草芽胞杆YX72及其在防治烟草镰刀菌根腐病和促生中的应用，用于克服现有技术中缺陷。
[0005]本专利技术采用的技术方案为：一株枯草芽胞杆YX72，所述的枯草芽胞杆YX72的筛选和分析测定方法的操作包括以下步骤：步骤一：采集健康烟株根际土壤样本；步骤二：进行微生物分离，采用稀释涂布平板法，从土壤中分离纯化细菌菌株，并计算抑菌率；步骤三：筛选拮抗菌株，利用平板对峙培养法，以烟草尖孢镰刀菌和茄病镰刀菌为靶标病原菌，筛选拮抗细菌；步骤四：拮抗菌株的抑菌谱测定，采用平板对峙培养法，进行生防菌株对多种常见烟草病原真菌抑菌试验，从而筛选出具有较强抑制作用且抑菌谱广的拮抗菌株；步骤五：拮抗菌株对烟草种子萌发及促生作用测定，采用培养皿滤纸保湿法，测量种子萌发及计算增长率；步骤六：拮抗菌发酵滤液的抑菌活性测定，制备拮抗菌发酵滤液，采用平板打孔法测试生防菌发酵滤液的抑菌作用，测定拮抗菌发酵滤液对病原菌孢子萌发的影响作用；步骤七：拮抗菌挥发性化合物的抑菌活性测定，计算相对抑菌率；步骤八：拮抗细菌的鉴定，结果显示菌株YX72的16S rDNA基因序列与枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)YD28(KY887763.1)等的序列相似性达到99％，且位于同一进化分支；步骤九：拮抗细菌对镰刀菌根腐病的盆栽防效及生防菌促生作用的测定，挑出大小一致的健壮烟苗，将烟苗根部浸泡于在拮抗细菌悬浮液中，进行拮抗菌悬浮液灌根，设置对照组，根据中华人民共和国国家标准(GB/T23222
‑
2008)中烟草根茎类病害分级及调查方法调查发病情况，计算发病情况及生防菌防效。
[0006]上述的枯草芽胞杆YX72在防治烟草镰刀菌根腐病和促生长中的应用。
[0007]本专利技术有益效果是：首先，本专利技术筛选出的枯草芽胞杆YX72对烟草尖孢镰刀菌和茄病镰刀菌具有良好的拮抗作用，对多种常见烟草病原真菌抑菌具有较强的抑制效果，通过平板对峙法结果显示，该菌株对烟草尖孢镰刀菌的平均防效为55％，对茄病镰刀菌的平均防效为73.54％，对多种常见烟草病原真菌抑菌具有较强的抑制效果，该菌株对茄病镰刀菌的平均抑菌率为77.06％，对尖孢镰刀菌、烟草疫霉菌、烟草根串珠霉和鸢尾丝囊霉菌的抑菌率均大于50％，对烟草白绢病菌、立枯丝核菌和葡萄座腔球菌的抑菌率在44.24％
‑
48.76％之间；其次，本专利技术筛选出的枯草芽胞杆YX72对烟草种子萌发及促生作用效果好，对靶标病原菌尖孢镰刀菌的菌丝生长具有显著抑制作用，拮抗菌株YX72发酵滤液均能抑制病原菌孢子萌发，种子萌发率提高了6.00％，该菌株处理烟苗根系平均增长率达到了67.86％，抑菌率为54.65％，LB液体培养基处理病原菌孢子萌发率达到45％以上，拮抗菌发酵滤液处理尖孢镰刀菌孢子萌发率为3.33％，其滤液可完全抑制茄病镰刀株菌孢子萌发；再次，本专利技术筛选出的枯草芽胞杆YX72对镰刀菌根腐病的盆栽防效及生防菌促生作用效果好，对烟草尖孢镰刀菌和茄病镰刀菌根腐病的平均防效均为100％，使得本专利技术可作为防治烟草镰刀菌根腐病和促生长中的应用的有效手段。
附图说明
[0008]图1为本专利技术的枯草芽胞杆YX72发酵滤液的抑菌活性对照图，A为未放发酵滤液处理图，B为发酵滤液处理图。
[0009]图2为本专利技术的拮抗菌挥发性有机化合物抑菌活性测定图，上排为尖孢镰刀菌，下排为茄病镰刀菌，左侧为CK处理,右侧为YX72处理。
[0010]图3为本专利技术的拮抗细菌的基于16S rDNA构建的系统发育树。
具体实施方式
[0011]如图1、2、3所示，一株枯草芽胞杆YX72，所述的枯草芽胞杆YX72的筛选和分析测定方法的操作包括以下步骤：步骤一：采集健康烟株根际土壤样本，采集河南豫中和豫西烟区健康烟株根际土壤本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一株枯草芽胞杆YX72，其特征在于：所述的枯草芽胞杆YX72的筛选和分析测定方法的操作包括以下步骤：步骤一：采集健康烟株根际土壤样本；步骤二：进行微生物分离，采用稀释涂布平板法，从土壤中分离纯化细菌菌株；步骤三：筛选拮抗菌株，利用平板对峙培养法，以烟草尖孢镰刀菌和茄病镰刀菌为靶标病原菌，筛选拮抗细菌，并计算抑菌率；步骤四：拮抗菌株的抑菌谱测定，采用平板对峙培养法，进行生防菌株对多种常见烟草病原真菌抑菌试验，从而筛选出具有较强抑制作用且抑菌谱广的拮抗菌株；步骤五：拮抗菌株对烟草种子萌发及促生作用测定，采用培养皿滤纸保湿法，测量种子萌发及计算增长率；步骤六：拮抗菌发酵滤液的抑菌活性测定，制备拮抗菌发酵滤液，采用平板打孔法测试生防菌发酵滤液的抑菌作用，测定拮抗菌发酵滤液对病原菌孢...

【专利技术属性】
技术研发人员：邱睿，白静科，董宁禹，刘东升，李小杰，李成军，赵均，陈玉国，苏新宏，宋瑞芳，房文祎，李彩虹，张盈盈，李淑君，陈彦春，杨晋燕，
申请(专利权)人：河南省农业科学院烟草研究所，
类型：发明
国别省市：