一株驴源马红球菌及其在制备灭活疫苗中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一株驴源马红球菌及其在制备灭活疫苗中的应用；本发明专利技术从多例病死驴的化脓性肺炎肺脏样品中，通过细菌分离、鉴定和小鼠致病性试验，筛选出一株具有强致病性的驴源马红球菌。本发明专利技术还公开了驴源马红球菌在制备灭活疫苗中的应用，包括：菌株培养、菌液灭活获、加入佐剂，获得灭活疫苗。本发明专利技术的灭活疫苗安全性高，无毒性，工艺简单可靠。使用本申请制备的驴源马红球菌灭活疫苗用于驴群马红球菌的防治，免疫后产生的抗体效价高，能有效地减少驴源马红球菌感染小鼠致死的情况发生，可以避免药物带来的耐药性以及药物残留。避免药物带来的耐药性以及药物残留。

【技术实现步骤摘要】
一株驴源马红球菌及其在制备灭活疫苗中的应用


[0001]本专利技术涉及疫苗制备
，具体为一株驴源马红球菌及其在制备灭活疫苗中的应用。

技术介绍

[0002]马红球菌(Rhodococcus equi，R.equi)是马群聚居地常见的一种存在于土壤中的兼性细胞内寄生的革兰氏阳性球杆菌，小于6月龄的驴驹发病率较高，且其致死率可达80％以上，病理表现为慢性或亚急性支气管肺炎和广泛性肺部脓肿，有时伴发盲结肠和肠系膜淋巴结溃疡。在临床表现上，早期病原在肺部扩散缓慢，驴驹对进行性肺功能丧失有强大的补偿能力。临床表现不明显，仅仅包括温和的发热或轻微的呼吸频率增加，诊断较为困难。当疾病进展到肺炎时，可出现厌食、昏睡、发热、心动过速、发生化脓性肺炎，呼吸迫促，鼻翼扩张、腹氏呼吸、鼻腔流脓液性分泌物，以后转为脓性，多因脓毒败血症而死。马红球菌感染驴驹导致的支气管肺炎、呼吸道症状甚至死亡不仅严重地影响驴驹的生产性能还导致驴驹的淘汰或死亡，给养驴场造成巨大的经济损失。研究调查发现，马红球菌感染在我国山东及新疆地区驴场频发，是危害我国驴产业发展的重要病原。目前，我国还没有针对马红球菌病的商品化疫苗，该病的防治主要还是依赖于药物，然而药物使用的种种弊端也日益凸显，如耐菌株的产生和药物残留等。因此，进行马红球菌病疫苗的研制用于预防和控制该病具有重要意义。

技术实现思路

[0003]本专利技术的目的在于提供一株驴源马红球菌及其在制备灭活疫苗中的应用，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。
[0004]为了解决上述技术问题，本专利技术提供如下技术方案：
[0005]一株驴源马红球菌的分离方法，包括以下步骤：
[0006](1)无菌采集驴化脓性肺炎肺脏样品，接种至脱纤维绵羊血脑心浸液琼脂平板，在30
‑
40℃，培养20
‑
25h后，选取适中的菌落在脱纤维绵羊血脑心浸液琼脂平板上连续纯化3次，即为纯化培养物；
[0007](2)将单个革兰氏阳性菌接种至脑心浸液肉汤中分别培养6h和12h，取步骤S1的纯化培养物在载玻片上制成涂片，对涂片进行革兰氏染色后，观察其形态，根据形态变化选取菌株后与马红球菌的相应序列进行比对，筛选后，即为一株驴源马红球菌。
[0008]较为优化的方案，步骤(2)中，选取菌株的形态变化为：球状变为杆状的革兰氏阳性球菌。
[0009]较为优化的方案，所述一株驴源马红球菌的保藏编号为CGMCC NO.24180，所述一株驴源马红球菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
[0010]较为优化的方案，分离出的一株驴源马红球菌用于制备一株驴源马红球菌灭活疫苗。
[0011]较为优化的方案，一株驴源马红球菌灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：
[0012]S1：取一株驴源马红球菌，接种至脑心浸液培养基中，在30
‑
40℃，180rpm培养20
‑
25h，即为驴源马红球菌菌液；
[0013]S2：将灭活剂加入至驴源马红球菌菌液中，在30
‑
40℃，180rpm灭活20
‑
25h，即为驴源马红球菌灭活菌液；
[0014]S3：将佐剂与驴源马红球菌灭活菌液混合均匀，即为驴源马红球菌灭活疫苗。
[0015]较为优化的方案，所述驴源马红球菌灭活疫苗中驴源马红球菌的抗原含量为2
×
10
10
CFU/mL
‑‑
2.5
×
10
10
CFU/mL。
[0016]较为优化的方案，步骤S2中，灭活剂为甲醛；步骤S3中，佐剂为铝胶佐剂。
[0017]较为优化的方案，步骤S3中，佐剂与驴源马红球菌的体积比为(1
‑
3)：(1
‑
3)。
[0018]较为优化的方案，一株驴源马红球菌灭活疫苗应用于驴的养殖过程中。
[0019]首先，本专利技术提供了一株驴源马红球菌，该菌株对驴的致病性强，制备的灭活疫苗安全，且该灭活疫苗具有良好的免疫保护性。本专利技术提供的一株驴源马红球菌是从多例病死驴的化脓性肺炎肺脏样品中，通过细菌分离和鉴定以及动物回归试验，筛选出的对驴具有致病性的驴源马红球菌SD1，该菌株于2021年12月22日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC NO.24180，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心地址为中国，北京，中国科学院微生物研究所。
[0020]其次，本申请将一株驴源马红球菌用于制备一种驴源马红球菌灭活疫苗，制备的驴源马红球菌灭活疫苗中驴源马红球菌SD1的抗原含量不低于2
×
10
10
CFU/mL。如果将马群中的马红球菌制成灭活疫苗用于驴的养殖过程中，会存在效果差异，因为对于驴而言，驴驹对于分离自驴的马红球菌相比于分离自马的马红球菌更加易感，即被感染的风险相对较高。分离自驴的马红球菌与分离自马的马红球菌对于本动物可以激活的免疫原性也有不同程度的差异。在分别使用驴源与马源不同来源细菌免疫驴驹后，驴驹在面对更易感染驴的细菌时，驴源分离株疫苗产生的保护效力会高于使用马源分离株疫苗。
[0021]与现有技术相比，本专利技术所达到的有益效果是：本专利技术从多例病死驴的化脓性肺炎肺脏样品，通过细菌分离和鉴定以及动物回归试验，筛选出一株对驴具有致病性的驴源马红球菌SD1，本专利技术的灭活疫苗制备方法简单，安全性好，能有效地预防驴源马红球菌SD1感染的发生。此外，驴源马红球菌灭活疫苗的制备可以用于驴群中马红球菌的防治，使该病的防治方式增多，可以避免药物防治带来的耐药性以及药物残留，无毒性，工艺可靠。
具体实施方式
[0022]下面将对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0023]实施例1：一株驴源马红球菌，包括以下步骤：
[0024]S1：纯化：无菌采集病死驴化脓性肺炎肺脏样品，每份样品分别划线接种于5％(V/V)脱纤维绵羊血脑心浸液琼脂平板，37℃培养24小时，挑取中等大小、边缘整齐、光滑湿润、圆形凸起的菌落，在5％(V/V)脱纤维绵羊血脑心浸液琼脂平板上连续纯化3次，获得纯化培
养物；
[0025]S2：分离：取步骤S1的纯化培养物，均匀地涂布在载玻片上制备成涂片，经革兰氏染色后显微镜观察细菌形态，选取单个革兰氏阳性菌，接种至脑心浸液肉汤中分别培养6h和12h后，利用革兰氏染色观察形态变化，选取菌体形态有由球状变为杆状的革兰氏阳性球菌，备用；
[0026]S3：鉴定：提取步骤S2筛选的菌株的基因组DNA，利用16s rDNA引物扩增分离菌的16S rDNA基因，16S rDNA的PCR扩增细菌16S rDNA的通用引本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一株驴源马红球菌的分离方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)无菌采集驴化脓性肺炎肺脏样品，接种至脱纤维绵羊血脑心浸液琼脂平板，在30
‑
40℃，培养20
‑
25h后，选取适中的菌落在脱纤维绵羊血脑心浸液琼脂平板上连续纯化3次，即为纯化培养物；(2)将单个革兰氏阳性菌接种至脑心浸液肉汤中分别培养6h和12h，取步骤S1的纯化培养物在载玻片上制成涂片，对涂片进行革兰氏染色后，观察其形态，根据形态变化选取菌株后与马红球菌的相应序列进行比对，筛选后，即为一株驴源马红球菌。2.根据权利要求1所述的一株驴源马红球菌的分离方法，其特征在于：步骤(2)中，选取菌株的形态变化为：球状变为杆状的革兰氏阳性球菌。3.根据权利要求1
‑
2任意一项所述的一株驴源马红球菌的分离方法分离得到的一株驴源马红球菌，其特征在于：所述一株驴源马红球菌的保藏编号为CGMCC NO.24180，所述一株驴源马红球菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。4.根据权利要求3所述的一株驴源马红球菌的应用，其特征在于：分离出的一株驴源马红球菌用于制备一株驴源马红球菌灭活疫苗。5.一株驴源马红球菌灭活疫苗的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：S1：取权利要求3所述的一株驴源马红球菌，接种至脑心浸液培养基中，在30<...

【专利技术属性】
技术研发人员：冯新，王卓，董建宝，朱伟，高楠楠，韩文瑜，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：