一种变性梯度凝胶电泳快速鉴定血液感染病原菌的方法技术

本发明专利技术适用于细菌检测领域，提供了一种变性梯度凝胶电泳快速鉴定血液感染病原菌的方法，包括以下步骤：步骤S1：血培养阳性瓶中细菌的分离；步骤S2：细菌特异性目的序列的获取，包括以下步骤：细菌DNA的提纯；细菌16SrDNA基因序列比对；引物设计与合成；PCR扩增目的序列；回收目的序列；步骤S3：变性梯度凝胶电泳鉴定细菌，包括以下步骤：试剂配制；DGGE变性胶的配方；梯度变性胶的制作和变性梯度凝胶电泳。本发明专利技术基于DGGE技术，加入变性剂(尿素和甲酰胺)，能够把同样长度但序列不同的DNA片段区分开，比常规使用的细菌鉴定方法提前两天得到结果，节省鉴定时间，降低检测成本，为临床早期治疗提供科学研究。疗提供科学研究。疗提供科学研究。

A method for rapid identification of pathogenic bacteria in blood infection by denaturing gradient gel electrophoresis

【技术实现步骤摘要】
一种变性梯度凝胶电泳快速鉴定血液感染病原菌的方法


[0001]本专利技术属于细菌检测领域，尤其涉及一种变性梯度凝胶电泳快速鉴定血液感染病原菌的方法。

技术介绍

[0002]目前临床进行细菌鉴定主要应用质谱技术，前期需要在血培养阳性瓶中震荡培养大量扩增细菌，同时还需涂板分离，才能进行质谱鉴定，中间耗费时间较长，成本也较高。
[0003]本申请通过DGGE对血培养阳性瓶中细菌进行菌种鉴定，旨在节省细菌鉴定时间，降低检测成本，为临床早期治疗提供科学研究。

技术实现思路

[0004]本专利技术实施例的目的在于提供一种变性梯度凝胶电泳快速鉴定血液感染病原菌的方法，旨在解决上述
技术介绍
中提出的问题。
[0005]为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
[0006]一种变性梯度凝胶电泳快速鉴定血液感染病原菌的方法，包括以下步骤：
[0007]步骤S1：血培养阳性瓶中细菌的分离；
[0008]步骤S2：细菌特异性目的序列的获取，包括以下步骤：细菌DNA的提纯；细菌16SrDNA基因序列比对；引物设计与合成；PCR扩增目的序列；回收目的序列；
[0009]步骤S3：变性梯度凝胶电泳鉴定细菌，包括以下步骤：试剂配制；DGGE变性胶的配方；梯度变性胶的制作和变性梯度凝胶电泳。
[0010]进一步的，所述步骤S1中，血培养阳性瓶中细菌的分离包括以下步骤：
[0011](1)将阳性血培养瓶反复轻微震荡，使瓶中液体混匀，取一次性注射器从瓶中抽取培养液涂于一次性玻片上，使其形成厚薄均匀的液体薄膜，晾干后用革兰染液染色，确定有细菌生长的为阳性标本，排除假阳性；
[0012](2)用75％无菌酒精消毒血培养瓶瓶口后，将血培养瓶轻微摇匀，用无菌注射器吸取5mL培养液，并注入到分离胶采血管内，室温下3000r/min离心2min，通过离心将碳粉及大部分红细胞分离到分离胶下层，将细菌离心至分离胶上层沉淀及上清液中，将离心后的上清液转移至EP管；
[0013](3)将EP管以5000r/min的转速离心5min，弃去EP管汇中的上清液，再加入200uL生理盐水于EP管中，混匀，以8000r/min的转速离心5min，最后弃去上清液，得到沉淀物备用。
[0014]进一步的，所述步骤S2中，细菌16SrDNA基因序列比对的具体步骤为：
[0015]从NCBI上查找细菌16SrDNA基因序列并下载，利用SnapGene软件进行基因序列比对，找到细菌16SrDNA基因序列差别最大的区域。
[0016]进一步的，所述步骤S2中，引物设计与合成的具体步骤为：
[0017]在细菌16SrDNA基因序列差别最大的区域的两端设计引物，利用Oligo6.44软件进行引物分析，在V3引物For5
’
端加入一个高熔点的40bpGC夹，引物序列为：
[0018]V3
‑
357F：CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG；
[0019]V3
‑
518R：ATTACCGCGGCTGCTGG。
[0020]进一步的，所述步骤S2中，PCR扩增目的序列的具体步骤为：
[0021]PCR扩增16SrDNAV3片段，引物使用V3
‑
357F，V3
‑
518R，利用Taq酶扩增目的片段。
[0022]进一步的，所述步骤S2中，回收目的序列的具体步骤为：
[0023]PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，把目的条带切胶回收，利用DNA回收试剂盒进行DNA回收。
[0024]进一步的，所述步骤S3中，试剂配制包括以下步骤：
[0025](1)50
×
TAE：称取37.2gEDTA
·
Na2和242gTris溶于适量ddH2O，搅拌溶解后加入57.1mL的冰醋酸混匀，ddH2O补齐至1L，即为50
×
TAE；
[0026](2)40％丙烯酰胺/甲叉丙烯酰胺：称取38.93g丙烯酰胺和1.07g甲叉丙烯酰胺溶于100mLddH2O，即为40％丙烯酰胺/甲叉丙烯酰胺；
[0027](3)50％尿素溶液：称取10g尿素溶于20mlRO水中，42℃水浴加热至固体完全溶解，即为50％尿素溶液；
[0028](4)DGGE固定液：50mL冰醋酸与450mLddH2O混匀后，即为DGGE固定液；
[0029](5)DGGE染色液：称取0.4gAgNO3固体溶于200mLddH2O，即为DGGE染色液；
[0030](6)DGGE显色液：称取5gNaOH溶于500mLddH2O，即为DGGE显色液。
[0031]进一步的，所述步骤S3中，梯度变性胶的制作和变性梯度凝胶电泳包括以下步骤：
[0032](1)将两块玻璃对齐放入电泳支架上，旋紧固定螺丝并夹好夹子，注入去离子水，检测是否漏水后倒出去离子水；
[0033](2)配制高变性剂浓度凝胶溶液和低变性剂浓度凝胶溶液，在灌胶前加入适量的10％过硫酸铵溶液和TEMED作为聚合引发剂和催化剂并充分混匀，关闭梯度混合仪的两个阀门，将高浓度变性剂凝胶溶液加入梯度混合仪靠近出口的一端，将低浓度变性剂凝胶溶液加入另一端，并打开磁力搅拌器；
[0034](3)先打开梯度混合仪出口端阀门，待液流稳定无气泡时将针头插入两块玻璃缝隙中部，接着打开梯度混合仪中间阀门开始灌胶；
[0035](4)待凝胶灌至距上端1.5cm处时停止灌胶，加入1mL去离子水液封胶面，待凝胶聚合后，配制不含变性剂的0％凝胶，用移液器灌胶，插好梳子，待凝胶完全聚合；
[0036](5)电泳缓冲液为10L1
×
TAE缓冲液，提前向电泳槽中加入9L缓冲液，提前2h预热至60℃，待上层胶凝固后，将胶板整个放入电泳槽，胶板上层中央补满缓冲液，拔出梳子，以电压100V预电泳30min后，用进样针上样，100V电泳30min后将电压改为80V，电泳15h；
[0037](6)电泳结束后，拿出电泳架取出玻璃，将一侧玻璃揭去取出凝胶，用SuperGelBlue染色30min后，置于凝胶成像仪中拍照。
[0038]与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：
[0039]该变性梯度凝胶电泳快速鉴定血液感染病原菌的方法，基于DGGE技术在一般的聚丙烯酰胺凝胶上，加入了变性剂(尿素和甲酰胺)，从而能够把同样长度但序列不同的DNA片段区分开来；本专利技术应用DGGE对血培养阳性瓶中细菌进行菌种鉴定，可比目前常规使用的细菌鉴定方法提前两天得到结果，节省鉴定时间，降低检测成本，为临床早期治疗提供科学研究。
附图说明
[0040]图1为PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果。
[0041]图2为变性梯度凝胶电泳结果。
具体实施方式
[0042]为本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种变性梯度凝胶电泳快速鉴定血液感染病原菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤S1：血培养阳性瓶中细菌的分离；步骤S2：细菌特异性目的序列的获取，包括以下步骤：细菌DNA的提纯；细菌16SrDNA基因序列比对；引物设计与合成；PCR扩增目的序列；回收目的序列；步骤S3：变性梯度凝胶电泳鉴定细菌，包括以下步骤：试剂配制；DGGE变性胶的配方；梯度变性胶的制作和变性梯度凝胶电泳。2.根据权利要求1所述的变性梯度凝胶电泳快速鉴定血液感染病原菌的方法，其特征在于，所述步骤S1中，血培养阳性瓶中细菌的分离包括以下步骤：(1)将阳性血培养瓶反复轻微震荡，使瓶中液体混匀，取一次性注射器从瓶中抽取培养液涂于一次性玻片上，使其形成厚薄均匀的液体薄膜，晾干后用革兰染液染色，确定有细菌生长的为阳性标本，排除假阳性；(2)用75％无菌酒精消毒血培养瓶瓶口后，将血培养瓶轻微摇匀，用无菌注射器吸取5mL培养液，并注入到分离胶采血管内，室温下3000r/min离心2min，通过离心将碳粉及大部分红细胞分离到分离胶下层，将细菌离心至分离胶上层沉淀及上清液中，将离心后的上清液转移至EP管；(3)将EP管以5000r/min的转速离心5min，弃去EP管汇中的上清液，再加入200uL生理盐水于EP管中，混匀，以8000r/min的转速离心5min，最后弃去上清液，得到沉淀物备用。3.根据权利要求1所述的变性梯度凝胶电泳快速鉴定血液感染病原菌的方法，其特征在于，所述步骤S2中，细菌16SrDNA基因序列比对的具体步骤为：从NCBI上查找细菌16SrDNA基因序列并下载，利用SnapGene软件进行基因序列比对，找到细菌16SrDNA基因序列差别最大的区域。4.根据权利要求3所述的变性梯度凝胶电泳快速鉴定血液感染病原菌的方法，其特征在于，所述步骤S2中，引物设计与合成的具体步骤为：在细菌16SrDNA基因序列差别最大的区域的两端设计引物，利用Oligo6.44软件进行引物分析，在V3引物For5
’
端加入一个高熔点的40bpGC夹，引物序列为：V3
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357F：CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG；V3
‑
518R：ATTACCGCGGCTGCTGG。5.根据权利要求4所述的变性梯度凝胶电泳快速鉴定血液感染病原菌的方法，其特征在于，所述步骤S2中，PCR扩增目的序列的具体步骤为：PCR扩增16SrDNAV3片段，引物使用V3
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357F，V3
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518R，利用Taq酶扩增目的片段。6.根据权利要求5所...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙巍，遇红梅，刘玲玲，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：